Summary
En mikrokanaler-on-en-brikke plattformen ble utviklet ved kombinasjonen av fotolitografisk teknikk reflowable fotoresist, myk litografi, og MicroFluidics. Den endothelialized microchannels plattformen etterligner den tredimensjonale (3D) geometrien in vivo microvessels, kjører under kontrollerte kontinuerlig perfusjon flyt, gir høy kvalitet og real-time imaging og kan brukes for mikrovaskulær forskning.
Abstract
Det har blitt fokusert på å utvikle in vitro-analyser for studiet av microvessels fordi in vivo dyrestudier er mer tidkrevende, dyrt og observasjon og kvantifisering svært utfordrende. Imidlertid konvensjonelle in vitro assayer microvessel har begrensninger når den representerer in vivo mikrovaskulatur med hensyn til tre-dimensjonale (3D) og geometri som gir kontinuerlig strømning. Ved hjelp av en kombinasjon av fotolitografisk reflowable fotoresist teknikk, myk litografi, og MicroFluidics, har vi utviklet en multi-dybde sirkulære tverrsnitt endothelialized microchannels-on-a-chip, som etterligner 3D geometri av in vivo microvessels og kjører under kontrollerte kontinuerlig perfusjon strømning. En positiv reflowable fotoresist ble brukt til å fremstille en master-formen med et halvsirkelformet tverrsnitt microchannel nettverk. Ved justering og bonding av de to polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels Replicated fra master mold, ble en sylindrisk microchannel nettverk opprettet. Diameteren på microchannels kan være godt kontrollert. I tillegg viste primære humane umbilical vene endotel-celler (HUVECs) sådd på innsiden av brikken at cellene foret den indre overflaten av mikrokanaler med kontrollert perfusjon som varer i et tidsrom mellom 4 dager til 2 uker.
Introduction
Microvessels, som en del av sirkulasjonssystemet, megle samspillet mellom blod og vev, støtte metabolske aktiviteter, definere vev microenvironment, og spiller en avgjørende rolle i mange helse-og patologiske tilstander. Gjentagelse av funksjonelle microvessels in vitro kunne gi en plattform for studiet av komplekse vaskulære fenomener. Imidlertid konvensjonelle in vitro microvessel assays, for eksempel endotelcellemigrasjon assays, endotelceller rør-formasjons-tester og rotte og mus aorta-ring analyser, ikke er i stand til å gjenskape in vivo mikrovaskulatur med hensyn til tre-dimensjonale (3D) geometri og kontinuerlig flytkontroll 1-8. Studier av microvessels med dyremodeller og in vivo, for eksempel hornhinnen angiogenese analysen, chick chorioallantoic membran angiogenese analysen, og Matrigel plug-analysen, er mer tidkrevende, høyt i pris, utfordrende med hensyn til observasjon og kvantifisering, ogta opp etiske problemstillinger 1, 9-13.
Fremskritt i micromanufacturing og microfluidic chip-teknologi har muliggjort en rekke innsikt i biomedisinsk vitenskap mens begrense de høye eksperimentelle kostnadene og kompleksiteten forbundet med dyr og in vivo studier 14, som enkelt og strengt kontrollert biologiske forhold og dynamiske fluidic miljøer, som ikke ville ha vært mulig med konvensjonelle mesoklimatisk teknikker.
Her presenterer vi en tilnærming for å konstruere en endothelialized microchannels-on-a-chip som etterligner 3D geometri av in vivo microvessels og kjører under kontrollerte kontinuerlig perfusjon flyten ved å bruke en kombinasjon av fotolitografisk reflowable fotoresist teknikk, myk litografi, og MicroFluidics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Photolithography Fabrikasjon av fotoresist Master Mold
Følgende protokoll viser prosedyren å fremstille de mikrokanaler med diametre mellom 30-60 mikrometer. For å få en microchannel med en mindre diameter (mindre enn 30 um), et spinn-belegg av fotoresist er nødvendig.
- Overfør den flyt fotoresisten fra kjøleskap ved 4 ° C til renrommet 24 timer før bruk, og tillate den å oppvarmes til romtemperatur.
- Rengjør en silisium wafer og bake den i en time ved 150 ° C for å la den tørke. Denne dehydrering vil bistå fotoresist vedheft til silisiumsubstrat.
- Spin-coat det første laget av fotoresist bruke følgende oppskrift:
| Trinn | Tid (sekunder) | (Rpm) | Akselerasjon |
| 1 | 2 </ Td> | 300 | høyeste |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | høyeste |
| 4 | 60 | 600 | høyeste |
| 5 | 10 | 500 | høyeste |
| 6 | 10 | 600 | høyeste |
- Deretter bake skiven på en varmeplate med en temperatur på 110 ° C i 90 sek. Etter at den myke bake tykkelsen av fotoresist vil være 20-30 um.
- Spin strøk en andre lag av fotoresist etter samme oppskrift brukes for første laget.
- Myk bake skiven igjen ved å plassere den på en varmeplate med en temperatur på 110 ° C i 90 sek. Etter denne myke bake tykkelsen av fotoresist vil være 40-60 um.
- Generere positive masterstudenter mønstre ved å utsette photoresist for UV-lys med en eksponering dose av 14 500 mJ / cm 2 gjennom en film maske.
- Fortynn utvikleren med deionisert (DI) vann (01:02 (v / v)). Skyll wafer gjentatte ganger i løsningen inntil mønsteret er fullt utviklet. Deretter vaskes wafer med DI vann og tørk den med nitrogengass.
- Reflow: Plasser wafer på en kokeplate med en temperatur på 120 ° C i 4 min og dekk med et glass petriskål å hindre løsemiddel fordampning. Fjern wafer fra kokeplaten og la den avkjøles til romtemperatur. Fotoresisten tykkelse etter flyt vil være 50-60 mikrometer.
2. Soft Litografi Fabrikasjon av PDMS microchannel Network
- Forbered polydimethylsiloxane (PDMS) løsning på vekten forholdet 10:1 (base: herder) og bland det grundig med en planetarisk sentrifugal blandebatteri.
- Kast PDMS løsning på tilpasset som flyt fotoresist mester mold. Plasser støpt PDMS i en eksikator i 15 min for å avlufte. Bruk nitrogengass for å fjerne eventuelle gjenværende bobler hvis nødvendig.
- Stek PDMS i en ovn ved en temperatur på 60 ° C i 3 timer for å tillate den å herde. Deretter fjerne herdet PDMS lag fra master mold.
- Bruk en skjerpet puncher å skape innløp / utløp hull ved punching hull i kanalen nettverket. Rens overflaten av PDMS ved hjelp av nitrogengass.
- Behandle to PDMS lag med oksygen plasma i 30 sekunder inne i en plasma renere på et driftstrykk på 4,5 x 10 -2 Torr og en oksygen flow rate på 3,5 ft 3 / min. Deretter justerer overflatene av PDMS manuelt under en optisk mikroskop. Bruk en dråpe vann om nødvendig for en bedre kontroll av innrettingen.
- Bake til enheten i en ovn ved 60 ° C i 30 min for å oppnå permanent binding.
3. HUVEC Kultur og Seeding i Chip
- Kultur på HUVECs med dyrkningsmedium med L-glutamin tilsatt 10% fetalt bovint serum (FBS). For the eksperiment passasjene mellom 2 og 5 ble benyttet.
- Når HUVECs er konfluente, tell cellene og høste dem ved først skylling av cellene med HEPES-bufret saltvannsoppløsning (HEPES-BSS), og deretter behandle cellene med trypsin / EDTA og inkuberes i 2-6 min ved 37 ° C. Etter trypsinering er fullført, nøytralisere trypsin / EDTA med trypsin nøytraliserende løsning. Sentrifuger og suspendere cellene i kultur medium med 8% dekstran å samle dem. Dekstran ble brukt til å øke mediets viskositet til å hjelpe til med bedre celle såing og vedlegg.
- Unn enheten med oksygen plasma i 5 min med et arbeidstrykk på 4,5 x 10 -2 Torr og en oksygen flow rate på 3,5 ft 3 / min. Deretter legger enheten med DI vann og behandle med UV lys for 8 timers i en laminær biosikkerhet hette for sterilisering.
- En dag før cellene er klare, vaske enheten 1x med fosfatbufret saltvann (1X PBS) og deretter belegge med fibronektin (100 ug / ml, diluted med 1X PBS) og inkuber i kjøleskap ved 4 ° C over natten.
- Etter fibronek belegg, vask enheten med 1x PBS deretter laste med kultur medium. Inkuber enheten ved en temperatur på 37 ° C i 15 min.
- Laste HUVEC celler i 8% dekstran kultur medium med en celle konsentrasjon på 3-4 x 10 6 celler / ml. Plasser en 20 pl dråpe av celler i den ene innløp av innretningen og vippe den til å innføre cellene i den mikrofluidteknisk kanal. Etter 15-20 min cellene vil begynne å feste til sideveggene av kanalene. Vri telefonen hver 15 min for å skape en mer ensartet fordeling av celler. Om nødvendig kan ytterligere lasting utføres.
4. Langsiktig Perfusjons Setup
Etter 5-6 timers statisk kultur, vil de vedlagte HUVECs begynne å fullt spre seg. Sett opp perfusjon ved hjelp av en fjernstyrt sprøytepumpe system med en jevn strøm av 10 mL / hr. Perfusjon kan justeres feller en høyere strømningshastighet, og kan vare i et tidsrom mellom 4 dager til to uker.
5. Cell Flekker og Microscope karakterisering
- Når cellene når samløpet inne i enheten, for det første, vask enheten med 1x PBS å grundig fjerne mediet. Deretter legger enheten med rødt fargestoff fortynnet med fortynningsmiddel (4 ul-1 ml). Laste fargestoffet lik den celle ladeprosedyren. Inkuber enheten i mørke i 5 min ved romtemperatur, og deretter vaske enheten med kulturmedium til stoppe farging. Lang inkubasjon av fargestoffet kan føre til cellulær toksisitet og disadhesion.
- Laster enheten med blått fargestoff fortynnet med 1x PBS (2 dråper pr ml). Inkuber i mørke i 5 min ved romtemperatur og deretter vaskes det med apparatet 1X PBS.
- Undersøke cellefarging under en invertert optisk mikroskop. Hvis flekkene var bra, laste microchannels med feste medium (3,5% paraformaldehyde fortynnet med 1x PBS), så senkenheten i å fikse medium og helt dekke den med aluminiumsfolie. Oppbevar enheten i kjøleskapet ved en temperatur på 4 ° C for å hindre enheten fra å tørke ut og photobleaching. Den faste enheten er nå klar for confocal bildebehandling, noe som kan gjøres ved en laser scanning konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår tilnærming for å fabrikkere den multi-dybde microchannel nettverk etterligner komplekse 3D Geometriene til in vivo mikrovaskulatur, der mikrokanaler har avrundet tverrsnitt 15.. I tillegg viser diameter på overordnede kanaler og forgreninger datterproduktene kanaler omtrent adlyde Murray lov for å opprettholde fluidstrømmen ved et ønsket nivå, slik at den samlede motstand kanalen er lav og strømningshastigheter er mer ensartet gjennom hele nettverket 16-18. Prosesser og resultater for fabrikasjon av en halvsirkelformet fotoresist mester mold og et sirkulært tverrsnitt PDMS microchannel nettverk ble vist i en film, figur 2, og Movie 2, henholdsvis. De geometriske trekk ved PDMS microchannel nettverk ble karakterisert og vist i figur 2. Våre resultater viser at fotoresist reflow teknikken kan skape multi-dybde forgrening kanal nettverk ina mer praktisk tilnærming ved fotoresistens flyt teknikker, og la utformingen av mikrovaskulære biomimetic systemer hvorav ca adlyder Murray lov.
I mange in vitro-modeller, er vaskulære celler vanligvis dyrket på plane plater, filtre eller disse underlag belagt med hydrogeler. Under disse forholdene microvessels er tilfeldig generert av mobilnettet selvbygging. I tillegg er konvensjonelle analyser har iboende vanskeligheter i å oppnå en konstant strøm i løpet endotelceller. Mangelen på en langvarig og kontinuerlig mediastrøm hindrer evnen til å opprettholde stabiliteten av endotel celle monolag med passende barriere funksjoner. I vår modell er fordelen søker MicroFluidics praktisk for væske tilgang og kontroll (varierende gjennomstrømning, varighet og mønstre) samt å bli kvitt avfall. Vi viser prosessene for primære humane navlestrengsvenen endotelceller (HUVECs) seeding i microchannels og sette ting en langsiktig væske perfusjon system for cellekultur (figur 3). Videre, på grunn av de komplekse geometrier in vivo microvasculature, er sanntids overvåking av disse små fartøy vanskelig. Den utviklet PDMS baserte brikken har gode optiske egenskaper og gir mulighet for høy kvalitet og real-time imaging av endothelialized microchannels. (Figur 4 og Movie 3)
Movie 1. Skjematiske fabrikasjon prosedyrer for fotoresistens mestre muggsopp. Utgangspunktet var en pre-renset silisium substrat forberedt. Den positive flyt fotoresist sjikt ble spinn-belagt på silisiumsubstrat og ble bakt og tørket. Fotoresisten ble eksponert for UV-lys gjennom en maske mønstret, og deretter ble de mønstrede mikrokanaler utvikles. En halvsirkelformet tverrsnitt microchannel nettverket ble opprettet etter flyt ved 120 ° C i 4 min.movie1.wmv "target =" _blank "> Klikk her for å se filmen.
Figur 1. SEM viser den utviklede fotoresist a) før flyt,. B) etter flyt, c) støpt PDMS viser tverrsnitt av den motstå før reflowing, bildet har et rektangulært tverrsnitt, d) støpt PDMS viser et halvsirkulært tverrsnitt av den motstå etter reflowing; Tverrsnittet etter flyt ble kontrollert av den opprinnelige dimensjon utformingen av mønsteret og flyt temperatur. (Gjengitt med tillatelse fra Reference 15). Klikk her for å se større figur .
Movie 2. Skjematisk fabrikasjon prosedyrer for sylindriske microchannel nettverk i PDMS. PDMS En oppløsning ble støpt på det fotoresistente formen og herdet i ovnen ved en temperatur på 60 ° C i 3 timer. To identiske kurert PDMS lag, som hver har en halvsirkelformet tverrsnitt microchannel nettverk, ble justert og limt sammen for å danne microchannels med sirkulære tverrsnitt. Klikk her for å se film .
Figur 2. a) En justert og limt sylindrisk microchannel nettverk i PDMS. bd) Rundskriv tverrsnitt av PDMS muggsopp viser kanaldimensjonen på hver forgrening nivå (1-1 ', 2-2', og 3-3 '). I tillegg er disse tallene viser etableringen av en multibranching og multidepth sirkulært tverrsnitt microfluidic kanal nettverk.
page = "always"> 
Figur 3. Skjematisk diagram som viser den langsiktige perfusjon gjennom brikken ved hjelp av en fjernstyrt sprøytepumpe.
Figur 4. Mikroskopi bilder ved hjelp av fluorescerende cellemembranen fargestoff (rødt) og celle kjernefysisk fargestoff (blå) viser at HUVECs linje den indre overflate av en sylindrisk microchannel nettet med forskjellige forgreninger regioner. A) Topp, b) Midt, og c) bunn. D) Konfokalmikroskopi bildet viser det sirkulære tverrsnitt av HUVECs langs kanalen nettverket. Scale barer: 100 mikrometer.
Movie 3. Confocal film som viser cellen lining langs sirkulær kanal nettverk.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "target =" _blank "> Klikk her for å se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En. Master mold fabrikasjon
En av de designe og førende for vaskulær morfometri er kjent som Murray lov 16, som sier at fordelingen av fartøy diameter i hele nettverket er styrt av minimum energi betraktning. Det sier også at tredje potens av diameteren i et overordnet fartøy ved en todeling er lik summen av de terninger av diametrene av datteren fartøy ( 
) 19 I tillegg har Poiseuille lov blitt brukt til å anslå størrelsen av den skjærspenning i de fleste av vaskulaturen 
. i hvilken1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" 25px "/> er den hemodynamiske skjærspenning, er μ blod viskositet, Q er vannmengden, og R er radius av Fartøyet 20,21. For symmetriske bifurcations, en viktig konsekvens basert på Murray lov og Poiseuille lov er at veggen skjærspenning forblir konstant gjennom vaskulære nettverk. Derfor, for en fabrikkert symmetrisk microfluidic kanal nettverk med sirkulære tverrsnitt, hvis kanalen dimensjoner på bifurcations adlyde Murray lov, bør skjærspenning oppleves av endotelceller være konstant på ulike forgreninger kanaler.
Mange microfabrication teknikker og prosesser har blitt brukt til fabrikasjon av microchannels brukes for vaskulære celler 22-25 imidlertid ført de resulterende microchannels i rektangulære, firkantede eller trapesformet tverrsnitt av kanaler. Den rektangulære tverrsnitt av kanaler er coninstruerte med skarpe hjørner og brå overganger på bifurcations, som kan pålegge ulik væske skjær stress og nonphysiological geometrier på celler i ulike kanalplasseringer, noe som resulterer i variasjoner i cellefysiologi 26,27.
En fotoresist reflowprosessen, noe som resulterer i en kanal avrundet profil, omfatter to prosedyrer, 1) smelting av den mønstrede fotoresist og væsken motstår flater er trukket inn i en form som minimaliserer energien i systemet 28,29 og 2) en kjøle-og størkning fasen følger smelteprosessen. Formene på tilpasset flyt kanaler er godt rundet av en semicylindrical overflate. Etterfulgt av tilpasset som flyt masteren mugg fabrikasjon, ble en standard myk litografi tilnærming brukes til å fabrikkere PDMS mikrofluidteknisk kanal nettverk med et sirkulært tverrsnitt. Våre resultater viste at fotoresist reflow teknikken kan skape multi-dybde forgrening microchannel nettverk i en mer straightt frem tilnærming, og gir oss mulighet til å designe mikrovaskulære biomimetic systemer som ca adlyder Murray lov og etterligne geometrien in vivo microvasculature, slik at den samlede kanalen motstanden er lav, og Skjærspenningen variasjoner på ulike forgreninger nivåer kan minimeres i den fabrikkerte microfluidic kanal nettverk.
De fysiologiske blod microvessels vedta en omtrent sirkelformet tverrsnitt med radius mellom 30-300 mikrometer 30. Målene for den påviste microchannel nettverk i dette papiret var variert rundt 60 mikrometer til 100 mikrometer på ulike forgreninger nivåer. Å dikte microchannels med forskjellig utvalg av diametre for å etterligne in vivo microvessels, anbefaler vi å bruke singel spunnet lag flyt motstå (begrenset til 30 mikrometer) eller andre lavere viskositet motstår. For en microchannel med større diameter (30-60 mikrometer), kan en dobbelt-belegg fremgangsmåte følges for å få et tykkere fotoresistent film15. Ytterligere spin-belegg over to lag bør unngås for å forhindre ikke-jevn film-tykkelse, noe som kan resultere i en unøyaktig eksponeringsdose. For en film tykkelse over 60 mikrometer, er andre høyere viskøse flyt photoresists anbefales.
I en ideell tilstand, å fabrikkere en motstå formen med et halvsirkelformet tverrsnitt, kan filmtykkelsen være utgangspunktet forhåndsbestemt ved å gi en ønsket bredde og brennvidden til som microchannel 
, Hvor H er det aktuelle skilt-filmtykkelse, r halvdelen av kanalbredden, r er konstant krumnings-radius, h er høyden av den sentrale krumningen, og E er forholdet mellom motstå volumer av microchannel før og etter reflowing 31. For en sylindrisk flate av en gitt bredde av microchannel, er et spesielt volum av den re motståquired. Imidlertid har flere parametere blitt rapportert å påvirke tilpasset som flyt fotoresist og gjøre det resulterende kanal-profilene mer kompliserte, for eksempel den kritiske vinkel og grense bevegelse mellom fotoresisten og det faste substrat, materiale fordamping under flyt baking, temperatur og tid for reflowprosessen, utgassing, substrat ensartethet, og motstå egenskaper 32-34. For eksempel kan den flyt temperatur og tid resultere i en forandring i volum forårsaker grense bevegelsen og dermed variere den kritiske vinkel, og loddekulene om-smeltes motstå endelige profil 33.. Som rapportert av våre tidligere arbeid 15, redusert reflowprosessen kanalen bredder med 2% i gjennomsnitt på grunn av fotoresistens volumnedgang og grensen bevegelse. I tillegg må volumet for å få en sylindrisk overflate for å ta høyde for effekten av materialet fordampning under reflowprosessen 35,36. Hvis sylindriske overflater med forskjellige radier er pålagt gjennommicrochannel et nettverk, er det nødvendig å variere bredden på mikrokanaler, noe som resulterer i variasjoner i volumene til forskjellige regioner i nettet 15.. Å kunne dikte opp en sylindrisk kanal nettverk med ulike diametre, den motstår bredder / volumer, flyt temperaturer og timing, kritiske vinkler, grense bevegelse, motstå viscosities og spin coating protokoller, og underlaget egenskaper må vurderes og testes.
2. Langsiktig cellekultur
Betydningen av strømning og den tilhørende vegg skjærspenning er vel anerkjent i regulering endotelial biologi. Dette har blitt sett på områder som indusere forandringer i cellen form og orientering, sekresjon og organisering, spredning og differensiering, intracellulære signalveier, cytoskeleton protein produksjon og genekspresjon, fartøy modning og struktur, og barriere funksjoner 37-47. Den nåværende in vitro metoder for å danne endenothelial rør generelt stole på endotelceller '(ECS) selvorganisering med eller uten mesenchymalceller i ekstracellulær matrix (ECM) (type I kollagen, fibrin eller Matrigel) 48-54. Selv om disse kulturene har blitt modellert flere mikrovaskulære atferd, de kunstige fartøy dannet gjennom en tilfeldig prosess med morphogenesis mangler ønsket romlig reproduserbarhet og orientering. I tillegg gjenstår virkningen av flyt på mikrovaskulær stabilitet i stor grad ukjent fordi disse selvkonfeksjonerte fartøyene ikke lett kombinere luminal flyt med en 3D rørformet organisasjon 55, utfordrer tekniske blodårene til å ha barriere funksjoner og langsiktig vaskulær stabilitet.
Microfluidic systemene har vist seg å være praktisk og nyttig for innføring av strømmer av en rekke biokjemiske og biologiske analyse 56,57. Vår tilnærming er en praktisk måte å innføre væskestrømmen over dyrkede celler. Vi brukte enavanserte fjernstyrte sprøyte pumpe for å oppnå en praktisk, men samtidig stødig og nøyaktig flyt kontroll gjennom microchannels for langsiktig cellekultur (mellom 4 dager og 2 uker).
3. Cellekultur i brikken
Plasma-assistert oksidasjon av PDMS microchannels introduserer silanolgruppene (SiOH) på flater som gjør overflaten hydrofile og hjelpemidler i ytterligere protein belegg. Forskjellige ECM-proteiner (fibronektin, gelatin og kollagen) ble testet for celleadhesjon, og det beste resultat ble funnet å være fibronektin belegg. De HUVECs ble fremstilt ved en konsentrasjon på 3 x 10 6 celler / ml i dyrkningsmedium supplert med 8% dekstran (70 kDa) for såing. Dekstran øker viskositeten av mediet for å muliggjøre god kontroll over seeding tettheten av ECS.
En konfluent monolag ble utviklet mellom 2-4 dager av HUVECs blir utsatt for en konstant medium flyt. For å visualisere cellene etter atcellekultur, merket vi celler med membran flekker og kjerner flekker fargestoffer, viste disse fargestoffer lavere cytotoksisitet 58. Vi farges cellene som et vedheftende monolag dyrket i brikken. En komplett 1X PBS vask er nødvendig for å hindre ekstra fargestoffer innesperret i brikken.
I sammendrag, ved en kombinasjon av flyt fotoresist teknikk og PDMS replikasjon, ble det utviklet flere dybde microchannel nettverk tilnærmes med en sirkulær overflate og kanalens diameter ved hver bifurkasjon ca adlyde Murray lov. Skjærspenningen variasjoner på forskjellige nivåer forgrening kan minimeres i den fabrikkerte mikrofluidteknisk kanal nettverk. I tillegg, indikerte resultatene fra cellekultur den friske tilstand i det endoteliale celler. Således, de utviklede endothelialized mikrokanaler-on-en-brikke gir en rask og reproduserbar metode for å lage sirkulært tverrsnitt med flere forgreninger og multidepth microchannel nettverk, som etterlignergeometrien av in vivo mikrovaskulatur. Prosedyren illustrerer bruken av unike evner i avansert micromanufacturing og microfluidic teknologi for å skape en microvasculature modell med en langsiktig, kontinuerlig perfusjon kontroll samt høy kvalitet og real-time imaging evne. Med den økende nytten av microfluidic kanaler for cellebiologi, tissue engineering, og bioteknologi programmer, de endothelialized microchannels-on-a-chip er en potensiell analysen for mikrovaskulær forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble delvis støttet av National Science Foundation (NSF 1.227.359), WVU EPSCoR program finansiert av National Science Foundation (EPS-1003907), WVU ADVANCE kontor sponset av National Science Foundation (1.007.978), og WVU PSCoR, henholdsvis. Den microfabrication arbeidet ble gjort i WVU Delte Forskning Fasiliteter (renrom anlegg) og Microfluidic Integrative Cellular Forskning på Chip Laboratory (Microchip Lab) ved West Virginia University. Den confocal bildebehandling ble gjort på WVU mikroskop Imaging Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
- Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , 1st edition, Biota Publishing. (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , Springer. (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. , 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
- O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G.
- Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. , VCH Publishers. New York. (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W.
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
