Summary
Denne protokol beskriver eksperimentelle procedurer til at vurdere differentiering af plasmacytoid dendritiske celler i Peyer patch fra fælles dendritiske celle stamceller ved hjælp af teknikker, der involverer FACS-medieret celle isolation, hydrodynamisk genoverførsel, og flow analyse af immun delmængder i Peyers patch.
Abstract
Denne protokol beskriver en metode til at analysere evnen af oprensede hæmatopoietiske progenitorer til at generere plasmacytoid dendritiske celler (PDC) i tarm Peyerske plaques (PP). Fælles dendritiske-stamceller (CDPs Lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) blev oprenset fra knoglemarven hos C57BL6 mus ved FACS og overføres til recipientmus, der mangler en væsentlig pDC befolkning i PP, i dette tilfælde, IFNAR'en - / - mus blev anvendt som overførselsmodtagere. I nogle mus blev overekspression af dendritiske cellevækstfaktor Flt3-ligand (Flt3L) fuldbyrdet før adoptiv overførsel af CDPs, ved hjælp af hydrodynamisk genoverførsel (HGT) af Flt3L-kodende plasmid. Flt3L overekspression udvider DC-populationer stammer fra overført (eller endogene) hæmatopoietiske stamceller. På 7-10 dage efter stamfader overførsel blev pdCs, der opstår fra de adoptivt overførte stamfædre skelnes fra modtagerceller pågrundlag af CD45 markør udtryk, med pdCs fra overførte CDPs være CD45.1 + og modtagere bliver CD45.2 +. Evnen af overførte CDPs at bidrage til pDC befolkning i PP og reagere på Flt3L blev vurderet ved flowcytometri PP enkelte cellesuspensioner fra recipientmus. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at teste, om andre progenitorpopulationer er i stand til at generere PP PDCs. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at undersøge den rolle, de faktorer, der forudsiges at påvirke pDC udvikling i PP, ved at overføre progenitordelmængder med en passende knockdown, knockout eller overekspression af det formodede udviklingsmæssige faktor og / eller ved at manipulere cirkulerende cytokiner via HGT . Denne metode kan også tillade analyse af, hvordan PP pdCs påvirker hyppigheden eller funktion af andre immun delmængder i KKS. En unik egenskab ved denne fremgangsmåde er anvendelsen af IFNAR - / - mus, som viser alvorligt reducerede PP pdCs forhold til vildtype dyr, derfor allowing rekonstituering af PP pdCs i fravær af forstyrrende effekter fra dødelig bestråling.
Introduction
Her viser vi en protokol at vurdere, om de fælles dendritiske-stamceller (CDPs) er i stand til at give anledning til plasmacytoid dendritiske celle (PDC) befolkning Peyers patch (PP). Det overordnede mål om at anvende denne metode var at evaluere den udviklingsmæssige regulering af pdCs i Peyer patch (PP pdCs). Grunden til dette er vigtigt, er, at PP pdCs afviger fra pdCs findes i andre væv, herunder knoglemarv, blod og milt, og det er derfor uklart, om PP pdCs og andre PDC populationer er udviklingsmæssigt og / eller funktionelt beslægtede. Konkret er pdCs almindeligt kendt for at være den vigtigste type I interferon (IFN) producenter inden for det hæmatopoietiske system, reagerer på Toll-lignende receptor 7 og 9 (TLR7 / 9) stimulation ved hurtig IFN-sekretion 1-3. Men PP pdCs er mangelfuld i produktion af type I IFN reaktion på TLR agoniststimulering 4,5. Desuden PP pdCs adskiller sig også fra pdCs findes i knoglemarv og milt ikræver signaler fra type I interferon (IFN)-receptor (IFNAR1) eller IFN signalering molekyle STAT1 for deres udvikling og / eller akkumulering 5. Disse data har foreslået muligheden for, at forskellige reguleringsmekanismer styrer PP pdCs versus pdCs i andre organer (f.eks knoglemarv, milt) 5.
Det rationale, der førte til udviklingen af denne fremgangsmåde var baseret på de seneste fremskridt i forståelsen dendritisk celle (DC) biologi. De fleste, hvis ikke alle, DC delmængder stammer fra hæmatopoietiske stamceller, der udtrykker FMS-lignende tyrosinkinase 3 receptor (Flt3) 6-10, men er DC udvikling ikke begrænset til klassiske myeloide og lymfoide veje. For eksempel FLT3 + fælles myeloide stamceller (CMPs, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcyR lo / -) giver anledning til CDPs (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +), which yderligere differentiering i pdCs og konventionelle udviklingslande (CDCS) 9,10. Derimod Flt3 + fælles lymfoide progenitorer (CLPS Lin - IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) udvikle primært i pdCs 11. Derfor forudgående undersøgelser tyder pdCs opstå fra mindst 2 forskellige hæmatopoietiske befolkninger under reguleringen af Flt3L selvom den typiske analyse er begrænset til knoglemarven, milten og / eller blod PDC delmængder. Således progenitorpopulationen (r), der genererer PP pdCs krævede undersøgelse. Forståelse oprindelsen af PP pdCs vil kaste lys over, om de deler fælles udviklingsmæssige veje med andre PDC befolkninger, eller benytte forskellige mekanismer i løbet af deres generation i PP.
En unik fordel af den fremgangsmåde, der er beskrevet heri, er brugen af mus, der viser en alvorlig mangel i PP pdCs som modtagere for adoptiv overførsel af hæmatopoietiske stamceller. Mus med genettic deletion i genet, der koder IFNAR1 (IFNAR - / - mus) og STAT1 (Stat1 - / -) afslørede en slående depletering i PP pdCs 5. Derfor disse stammer giver et miljø, hvor PP pdCs er reduceret, så adoptivforældre undersøgelser transfer, der skal udføres i fravær af potente celle ablation regimer som dødelig bestråling. En yderligere styrke metode præsenteres her, er brugen af hydrodynamiske genoverførsel (HGT) at stimulere forhøjede cirkulerende mængder af Flt3L. Dette tilvejebringer en omkostningseffektiv metode til at inducere Flt3L in vivo over for injektion af rekombinant protein. Talrige undersøgelser, herunder dem i vores laboratorium, har ansat HGT at fremkalde cytokin mængder i en række forskellige eksperimentelle betingelser 5,12,13.
Arbejdsdelingen og præcise immunfunktionerne for udviklingslandene er af stor interesse i immunologi. Navnlig pdCs er vigtige mediatorer af oral tolerance og systemisk anti-viralreaktioner, men de synes også at bidrage til udviklingen og persistens af autoimmunitet og cancer 14-17. Den heri beskrevne protokol vil give udviklingsmæssige mekanismer, der regulerer PP pdCs at være mere fuldt udforsket. Desuden kan denne tilgang kunne undersøgelser for at vurdere PP PDC-funktionen, og kan udvides til at forstå regulering og funktion af andre immun populationer i PPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionel godkendelse skal indhentes på forhånd for alle eksperimentelle manipulationer beskrevet heri involverer mus. Disse omfatter anvendelsen af C57BL6-mus til isolering af knoglemarvprogenitorceller, IFNAR - / - mus som modtagere for adoptiv overførsel af hæmatopoietiske progenitorer og anvendelse af HGT for cytokin overekspression in vivo. Passende bolig og pasning af dyr skal også gives af investigator eller institution. Desuden kan der kræves institutionelle godkendelse for plasmider, der anvendes i hydrodynamisk genoverførsel (dvs. rekombinant DNA-godkendelse). De her beskrevne undersøgelser blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på UT MD Anderson Cancer Center.
1.. Hydrodynamisk Gene Transfer (HGT)
Dette trin skal udføres 2 dage inden adoptiv overførsel af CDPs at fremkalde cirkulerende Flt3L for DC ekspansion in vivo 5.. Prepare mindst 5 modtager mus / gruppe.
- For at opnå en effektiv HGT, blodkarrene i modtagerens IFNAR'en - / - bør mus (CD45.2 +) blive forstørrede ved at udsætte mus til en varmelampe i 5-10 min.
- Anbring musen på en fastholdelsesanlæg enhed og desinficere halen med 70% ethanol.
- Injicer 5 ug plasmid, der koder Flt3L i 2 ml sterilt PBS i halevenen under anvendelse af en 27 G nål. Til kontrol kohorte injicere 5 ug af tom vektor (pORF) via halevenen som angivet.
- Monitor mus i 15-30 min for at sikre, at der ikke er nogen skadelige virkninger af haleveneinjektion. Retur mus til boliger facilitet for 2 dage.
2. Isolering af hæmatopoietiske Progenitorer fra museknoglemarvs
Dette trin skal udføres 2 dage efter HGT. Brug kongene CD45.1 + mus som kilde til knoglemarv progenitorer til adoptiv overførsel til modtageren IFNAR - /- dyr (CD45.2 +). I denne protokol, der kræves congene stammer at skelne donor og modtager afledt udviklingslande, samt for at undgå immun-medieret udtømning på grund af MHC mismatch. Ca. 10-20 mus vil være forpligtet til at levere et tilstrækkeligt antal hæmatopoietiske celler (10 5 celler / modtager mus) for overdragelsen eksperimenter.
- Afliv 10 congene CD45.1 + mus ved CO 2 kvælning og halsdislokation.
- Placer hver slagtekrop på en dissektion bakke og sterilisere maven og benene med 70% ethanol.
- Lave et snit i midten af underlivet og skære gennem huden fra maven til hvert ben, skære huden ned langs benet.
- Fjern forsigtigt huden fra hvert ben, og klippe og fjerne benene fra kroppen i hofteleddet hjælp skarp saks.
- Fjern forsigtigt musklerne fra lårbenet og skinnebenet af hvert ben ved hjælp af en skarp kniv.
- Fjernbegge ender af lårbenet og skinnebenet med en skarp skalpel og placere knoglerne i en kultur skål indeholdende komplet RPMI (RMPI med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1 mM natriumpyruvat og 50 uM β-mercaptoethanol) .
- Forbered en sprøjte indeholdende 1 ml komplet RPMI, som er forbundet til en 27 G nål.
- Sæt 27 G nål ind i den ene ende af femur eller tibia. Skyl knoglemarven fra lårbenet eller skinneben ved forsigtigt at sprøjte komplet RPMI ind i knoglen. Sørg for, at knoglemarvsceller bliver fjernet fra knoglen, dette kan ske ved visuelt at detektere bortvist medier, der vises uklar.
- Gentag skylning hver lårben og skinneben 3x til grundigt at fjerne knoglemarvsceller.
- Forbered en enkelt celle suspension ved forsigtigt at pipettere cellerne op og ned 3-5x i kulturen fad.
- Fjerne snavs ved at føre knoglemarvsceller gennem en 40 uM cellefilter, anbringelse af eksuderede celler i en ny kultue skålen. Sprænges eventuelle celleklumper der vises på sien ved let tryk med enden af en steril sprøjte stemplet.
- Lyse af røde blodlegemer (RBC) til stede i den samlede knoglemarven cellesuspension med kommerciel RBC-puffer ifølge fabrikantens anvisninger. Brug 2 ml RBC buffer/4-6 x 10 7 celler (generelt celler fra en mus) og en inkubationstid på 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vask knoglemarvsceller ved pelletering cellerne ved centrifugering i 4 minutter ved 500 xg, forsigtigt bortsuge dyrkningsmediet resuspendering i 10 ml FACS buffer (1x PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS), pelletering cellerne ved centrifugering og forsigtigt aspirering vask puffer.
- Gentag vask, som beskrevet i trin 2.13, i alt 2 vaske.
3. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) for at isolere CDPs
Dette trin kræver adgang til en MidiMACS celleseparator og MACS LD kolonner for en indledende negativ udvælgelsesproceduresamt en FACS maskine med mindst 3 lasere til at oprense den flerfarvet progenitor delmængde efter farvning med fluorescens-konjugerede antistoffer.
- Efter den anden vask i trin 2.14, tælle knoglemarvsceller. Pelletere cellerne ved centrifugering som beskrevet i trin 2.13 og resuspender i FACS-buffer til opnåelse af en slutkoncentration på 4 x 10 7 celler pr 30 pi FACS buffer.
- For at fremstille celler til FACS, er afstamning-negative celler først beriget med en negativ udvælgelse teknik, der fjerner afstamning-positive celler fra knoglemarven blandingen under anvendelse af magnetiske perler søjlekromatografi. For den negative udvælgelsesprocedure, tilsættes 1 ug af hvert af de følgende kommercielle rotte anti-muse-antistoffer (ABS), der genkender hæmatopoietisk linje markører: CD3, CD19, CD11c, CD11, og Ter-119 Abs. De Abs bør tilføjes et volumen på 2 gl / Ab til 30 pi cellesuspension i FACS buffer.
- Inkuber cellesuspensionen ved 4 ° C i 30min. Efter inkubation vaskes cellerne to gange med 10 ml FACS puffer som beskrevet i trin 2.13.
- Resuspender celler til opnåelse af en slutkoncentration på 4 x 10 7 cells/40 pi FACS buffer. Tilsæt 20 ul gede-anti-rotte IgG-magnetiske mikroperler pr hver 40 ul cellesuspension. Bland forsigtigt og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter. Vask cellerne med 10 ml FACS puffer som beskrevet i trin 2.13.
- Resuspender op til 10 8 knoglemarvsceller i 500 pi FACS buffer.
- Indlæse en MACS LD kolonne på en MidiMACS celleseparator pr fabrikantens anvisninger og forskylningen kolonnen med 2 ml FACS buffer.
- Anvend knoglemarven cellesuspension til kolonnen laste op til 5 x 10 8 celler i 2,5 ml FACS buffer. Sikre en samling rør (15 ml konisk rør) er placeret under kolonnen. Vask søjlen 3x med 2 ml FACS buffer / vask, og indsamle de celler, der passerer gennem søjlen, som vil blive beriget medslægt-negative celler. Tæl cellerne i materialet elueret (vaske-through) fra kolonnen.
- For at udføre positiv selektion af hæmatopoietiske progenitordelmængder ved FACS, bejdse celler med følgende fluorescens konjugerede Abs: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, plus en blanding af slægt markør Abs rettet mod CD3, CD19, CD11 c, CD11b, F4/80 og TER119 (alle mærket med PerCP Cy5.5). Brug 0.5-1 ul af hvert Ab i et samlet volumen på 100 ul. Inkuber cellesuspension ved 4 ° C i 20-30 minutter.
- Vask cellerne som angivet i trin 2.13 og resuspender i FACS-buffer i en koncentration på 2-3 x 10 7 celler / ml. Foretage celler gennem en 35 uM cellefilter kapselrøret at fjerne celleklumper. Det sidste skridt er afgørende at undgå tilstopning af FACS maskine.
- Placer celle suspension i en FACS rør på FACS scenen og sortere CDPs (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) påbasis af den markør profil. Saml oprensede celler i et 15 ml rør, som indeholder 5 ml komplet RPMI.
- Optag det absolutte antal sorterede celler ved udgangen af FACS-løb. Pelletere cellerne ved centrifugering som angivet i trin 2.13 og resuspender i sterilt PBS til adoptiv overførsel eksperimenter.
4.. Adoptiv overførsel af CDPs
Dette trin sker typisk i dyret facilitet, hvor de modtagende mus er opstaldet. Afhængigt af placeringen af FACS-maskine, kan det indebære transport af de oprensede stamceller populationer i dyreanlægget forud for adoptiv overførsel. Progenitorcellelinjer suspensioner bør holdes steril og transporteret på is.
- Forbered cellesuspensioner til injektion ved at fortynde 10 5 oprensede CDPs i et samlet volumen på 100 ul sterilt PBS. Placer cellesuspension i en sprøjte fastgjort til en 27 G nål.
- Expose modtageren IFNAR'en - / - +) til en varmelampe i 5-10 minutter for at opnå effektiv injektion via halevenen.
- Anbring musen på en fastholdelsesanlæg enhed og desinficere halen med 70% ethanol.
- Injicer 10 5 FACS-oprensede CDPs i 100 ul PBS i halevenen under anvendelse af en 27 G nål.
- Monitor mus i 15-30 min for at sikre, at der ikke er nogen skadelige virkninger af haleveneinjektion. Retur mus til boliger facilitet.
5.. Isolering af PP og måling af pDC Beløb
- På 7-10 dage efter adoptiv overførsel, aflive de modtagende mus. Åbn forsigtigt musen ved dissektion og eksponere tarmen.
- Fjern hele tarmen og placere den på PBS-gennemblødt papirservietter. Saml alle synlige PPs langs væggen af tyndtarmen med fin pincet og saks. C57BL6 og IFNAR - / - mus har typisk 5-10 PP / mus, som er forskellige fra isolerede lymfefollikler fundetlangs tyndtarmen 18. Bemærk, at PPS er ofte strukturelt forskellige, selv inden for en enkelt mus, så omhyggeligt sikre, at alle PP identificeres og dissekeres.
- Placer PP i en petriskål indeholdende PBS og pincet til at fjerne afføring. Gentag denne procedure to gange for at rengøre PPs.
- Digest PPs med 1 mg / ml collagenase IV i 10 ml 1x Hank balanceret saltopløsning (HBSS) i en 50 ml kolbe under kraftig omrøring i 1 time ved 37 ° C.
- Placer fordøjet PP i øverste rum af en 40 um cellefilter og tvinge celler gennem si med en steril sprøjte stemplet. Saml PP cellesuspension i et 15 ml konisk rør.
- Pelletere anstrengt PP cellerne ved centrifugering ved 500 xg i 5 minutter og resuspenderes i 6 ml 37% Percoll-opløsning (37% Percoll i RPMI-medium). Anbring forsigtigt 6 ml 70% Percoll-opløsning (70% Percoll i RPMI-medium) under cellesuspensionen til dannelse af en Percoll tringradient.
- Centrifuger cellerne i 20 min at 800 xg med centrifugen brække. Mononukleære celler vil migrere til 37/70% grænsefladen. Efter centrifugering skal mononukleære cellepopulation opsamles ved forsigtig pipettering på grænsefladeregionen. Pellet indsamles cellerne ved centrifugering og vaskes to gange i 50 ml komplet RPMI / vask. Et stort volumen for at sikre fuldstændig Percoll fjernelse.
- Farv de indsamlede PP celler med følgende antistoffer til påvisning murine pdCs, der stammer fra de adoptivt overførte ophav (CD45.1 +) eller recipientmus (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) og PDCA-1 (FITC) Abs. Udfør flowcytometri analyse af PP-celler som angivet i trin 3.9 og 3.10. Identificer pdCs ved deres CD11c + CD11 - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + fænotype. Absolutte PDC-numre kan bestemmes ved følgende ligning:% pdCs x tiltal PP celle nummer = PP pdCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores resultater viser gating strategi til isolering af CDPs fra muse-knoglemarvsceller (Figur 1), som beskrevet i protokol 2 og 3. CDPs omfatter cirka 0,1% af den samlede knoglemarvsceller, og omkring 4-6 x 10 4 CDPs kan isoleres fra en mus. Ved adoptiv overførsel, CDPs differentierer til pdCs og CDCS 10.
Figur 1.. Gating strategi for FACS oprensning af CDPs. Knoglemarvsceller blev indsamlet fra C57BL6 mus. Lineage-positive celler blev udtømt med Abs mod afstamning markører (CD3, CD19, CD11, CD11c, TER119) ved hjælp af MACS microbead-medieret valg. Den berigede slægt-negative knoglemarv befolkning blev farvet med fluorescens-mærket Abs til CDP og afstamning markører og renset ved FACS som vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
At identificere pdCs i KKS, bruger vi en indledende fremad og sidespredning gating-strategi, efterfulgt af gating for CD11c + Siglec-H + celler (figur 2A og 2B) IFNAR'en -. / - Mus har en betydelig reduktion i pdCs i KKS i forhold til vildtypemus (fig. 2B) 5.. Derimod CD11c + Siglec-H - findes CDCS på tilsvarende beløb i begge genotyper (figur 2b). Derfor IFNAR'en - / - mus giver mulighed for at undersøge PP pDC rekonstituering uden effekter af dødelig bestråling 5.. For eksempel adoptiv overførsel af vildtype CDPs i IFNAR - / - mus, som beskrevet i trin 4, stimulerer en stigning i PP pdCs (figur 2B). Desuden forbehandling med Flt3L HGT (trin 1) yderligere forbedret pDC ekspansion i PP (figur 2B), hvilket overførte CDPs og muligheden for endogene Flt3 + stamfædre reagere på Flt3L ved at inducere PP pdCs. Begge betingelser også stimuleret CD11c + Siglec-H - CDCS beløb i overensstemmelse med den udviklingsmæssige oprindelse CDCS 6. pdCs i KKS udtrykker traditionelle PDC markører herunder PDCA-1, Siglec-H og B220, og mangler CD11 (figur 2B-D) 4,5. Desuden analyse af PP fra IFNAR - / - mus, der modtog både Flt3L HGT og overføres CDPs viste, at hovedparten (~ 70%) af pdCs blev afledt fra donor (CD45.1 +)-mus (figur 2E). Tilsammen viser disse data, at adoptiv overførsel af CDPs inducerer PP pDC befolkningen i forbindelse Flt3L-medierede signaler in vivo.
indhold "fo: keep-together.within-side =" altid ">
. Figur 2. Analyse af PP pDC i IFNAR'en - / - mus upon Flt3L HGT og adoptiv overførsel af CDPs IFNAR'en -. / - Mus blev injiceret intravenøst med 5 ug plasmid, der koder Flt3L eller en tom vektor (pORF) af HGT. To dage senere blev 10 5 FACS-oprensede CDPs adoptivt overført via haleveneinjektion. Syv dage efter CDP overførsel, blev PPs indsamlet og analyseret for PDC beløb (A, B). CD11c + Siglec-H + pdCs i mus, der modtog CDPs + Flt3L HGT blev yderligere analyseret for PDCA-1, B220 (C), CD11 (D), CD45.1 og CD45.2 (E) ekspression. Ekspressionsmønsteret PDCA-1, B220 og CD11 var ens i pdCs i alle 3 grupper (dataikke vist). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adoptiv transfer teknik beskrevet heri vurderede bidrag CDPs til PP pDC befolkning i modtagerlandene mus, der er mangelfuld i PP pdCs (f.eks IFNAR - / - mus). I fremtidige eksperimenter, vil det være vigtigt at vurdere potentialet af andre progenitordelmængder generere PP pdCs, især hvorvidt PP pdCs stammer fra Flt3 + CLPS. Dette spørgsmål er vigtigt, fordi det er uklart, hvorfor PP pdCs er unikt følsomme over for IFNAR-STAT1 signaler for PP periodisering 5, og hvis PP pdCs følger lignende udviklingsforstyrrelser stikord som pdCs i andre organer.
I teorien kan denne fremgangsmåde også udføres i mus der mangler PDC populationer i alle organer. For eksempel mus med mangel i transskription faktor E2-2, PDC "master regulator" (dvs. Tcf4 - / - mus), vise slående pDC udtømning 19. Men Tcf4 - / - mice er embryonale letale og dermed Tcf4 - / - knoglemarv kimære mus vil skulle anvendes som modtagere for adoptiv overførsel eksperimenter. Det er dog stadig uvist, om PP pdCs er følsomme over for bestråling og effektivt vil være udtømt i Tcf4 - / - kimærer. Desuden dødelig bestråling har brede virkninger på hæmatopoietiske system og støtte stromale befolkningsgrupper, der kan påvirke PP pDC rekonstituering. Således er anvendelsen af IFNAR - / - mus som modtagerne at vurdere evnen til adoptivt overført progenitordelmængder at generere PP pdCs kan få forrang for Tcf4 - / -. kimærer Stat1 - / - mus viser også en slående reduktion i PP pdCs og kunne anvendes som modtagere til adoptiv undersøgelser transfer til undersøgelse PP pdc udviklingsmæssige oprindelse 5. En advarsel til anvendelsen af IFNAR - / - eller Stat1 - / - mus er deres immundefekte status, which kan påvirke PP pDC rekonstituering eller funktion i ukendte måder. Således ville uafhængige metoder til at vurdere PP PDC udviklingsmæssige oprindelse styrke tilliden til fortolkningen af data.
Teknisk set skal det bemærkes, at CDP befolkning er fundet på en meget lav frekvens i alt knoglemarv, således udtømning af slægt markør-positive celler ved magnetisk perle-medieret søjlekromatografi forud for FACS er vigtig for effektiv rensning af progenitorceller ved FACS. Denne udtømning trin beriger afstamning-negative celler, hvilket resulterer i nedsat FACS tid (og omkostninger) for stamfader rensning. Den nedbrydende fremgangsmåden beskrevet heri benytter en blanding af slægt-specifikke antistoffer, der er kombineret til hvert forsøg. Kommercielle afstamning antistof cocktails er også tilgængelige og kan anvendes til fjernelse af slægt-positive celler, i stedet for den blanding, som vi beskriver. Fordelen ved den beskrevne fremgangsmåde er dens fleksibilitet i at være passende til DIFskellige depletion formål, ved at justere de antistoffer, der er til stede i blandingen.
Ved fremstillingen af enkelte cellesuspensioner fra PP, er det vigtigt at fjerne så meget af den intestinale væv, der omgiver PPs som muligt. Dette kan opnås ved omhyggelig dissektion af PPs. Tilstrækkelig fordøjelse af PP med collagenase er et afgørende skridt til at frigive leukocytter fra tarmens væv. Percoll densitetsgradient centrifugering beskrevne teknik er en foretrukken fremgangsmåde til at berige leukocytter fra fordøjede PP prøver. Desuden er det vigtigt at bemærke, at pDC markørprotein PDCA-1 kan reguleres ved type I IFN og andre stimuli 20. Derfor er Siglec-H foretrukket som et PDC markør for undersøgelser med cytokin manipulation.
Brugen af HGT har en klar fordel i forhold til at være særdeles omkostningseffektiv. Mens Flt3L HGT blev anvendt i denne undersøgelse, evne til andre cytokiner eller opløselige faktorer regUlate PP pdCs kunne testes ved hjælp af HGT, i fraværet eller tilstedeværelsen af adoptiv celle transfer af hæmatopoietiske stamceller. HGT resulterer dog i en vedvarende produktion af cytokiner fra de overførte plasmid versus de mere forbigående stigninger under rekombinant cytokin indsprøjtning, som er afhængige af cytokin halveringstid 5,13. Den udvidede elevation af cirkulerende cytokin kan afvige fysiologiske mængder opnået under nødsituation bloddannende eller infektion svar. Denne advarsel bør holdes for øje under eksperimentelle stadier og vurdering af data planlægning.
I det fremtidige arbejde, selektiv manipulation af PP pDC befolkning, som beskrevet heri, kan støtte i håndteringen PP PDC-funktionen. PP pdCs er betinget af mediatorer til stede i slimhinden miljø og er mangelfuld i type I IFN produktion på TLR aktivering 4,5. Analyse af PP pdCs rekonstitueret inden Stat1 - / - mus viste disse ceLLS har en forholdsvis lav evne til at fremkalde type I IFN på TLR9 udløser i forhold til PP pdCs opstår naturligt (ikke vist), hvilket indikerer PP pdCs stammer fra overførte CDPs bevare mindst denne egenskab af naturlige PP pdCs. Den reducerede type I IFN produktion af PP pdCs kontrast til den robuste type I IFN sekretion af andre pdc befolkninger og rejser et spørgsmål vedrørende den funktionelle rolle af PP pdCs. Desuden PP pdCs ligne pdCs der udvikler sig i nærværelse af type I IFN en pDC befolkning, der demonstrerer en effektiv stimulering af IL-17-producerende CD4 + T-lymfocytter (Th17 celler) 5. Mens Th17 celler er almindeligt anset for at være en inflammatorisk-inducerende befolkning, de har både beskyttende og patogene roller i tarmen 21. Separat har pdCs blevet rapporteret at mediere systemisk tolerance over for oralt administreret antigen 15. Rolle PP pdCs i lokal og systemisk immunitet er af væsentlig interesse, som at forstå dette punkt kan afsløre new tilgange at manipulere tarm immune og inflammatoriske reaktioner i sygdom terapi.
Konklusionen er, at fremgangsmåden præsenteret heri muliggør vurdering af udviklingspotentiale hæmatopoietiske delmængder til generering PP PDCs. Denne procedure giver mus med rekonstituerede PP pdCs. Således kan denne tilgang ikke kun bruges til at vurdere PP PDC bloddannende oprindelse, men også for at forstå bidrag PP pdCs til immune funktioner i tarm miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Drs. Alex Gelbard og Willem Overwijk for rådgivning om hydrodynamisk genoverførsel. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (AI098099, SSW), MD Anderson Cancer Center for Epigenetik, MD Anderson Center for Inflammation og Kræft (SSW) og RE Bob Smith Education Fund (HSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
