Summary
这个协议描述的实验程序来评估浆细胞样树突细胞的Peyer氏从共同的树突状细胞前体细胞的补丁的分化，使用涉及FACS介导的细胞分离，水动力的基因转移，并在淋巴集结免疫子集流分析技术。
Abstract
该协议详细介绍了分析纯化造血祖细胞在肠道淋巴集结（PP）的产生浆细胞树突状细胞（PDC）的能力的方法。常见的树突状细胞前体细胞（个CDP，林-的c-kit 罗 CD115 +的Flt3 +）从C57BL6小鼠的骨髓中纯化，通过FACS，并转移到缺乏一个显著的pDC群中的PP受体小鼠，在这种情况下，IFNAR - / -小鼠用作转移接收者。在某些小鼠中，树突状细胞生长因子Flt3配体（FLT3L）的过度表达到代管个CDP转移之前执行，使用FLT3L编码质粒流体力学基因转移（HGT）。 FLT3L过度扩张DC群转自（或内源性的）造血祖细胞起源。在祖转让后7-10天，即产生过继转移的祖细胞的pDCs从受体细胞进行区分的CD45标志物表达，与转个CDP是CD45.1 +和受助人CD45.2 + pDCs细胞的基础。转个CDP的贡献到PDC人口PP和向FLT3L反应能力是由从受体小鼠的PP单细胞悬液流式细胞仪检测。此方法可用于测试其他祖种群是否能够产生PP的pDCs的。此外，该方法可用于检查被预测影响的pDC发育中的PP，通过将前体亚群与推定的发育因子和/或一个适当的击倒，敲除或过表达由通过HGT操纵循环细胞因子是因子的作用。此方法还可以使聚丙烯的pDCs如何影响在其他的PP免疫亚群的频率或功能分析。这种方法的特点是采用IFNAR的- / -小鼠，这表明严重枯竭PP的pDC相对于野生型动物，从而allowiPP的pDCs在没有从致命的辐射影响因子纳克重建。
Introduction
在这里，我们展示了一个协议，以评估共同树突状细胞祖细胞（个CDP）是否能够在浆细胞树突状细胞（PDC）人口淋巴集结（PP）引起。使用这种方法的总体目标是评估的pDC的淋巴集结（PP pDCs细胞）的发育调控。的原因，这是很重要的是，聚丙烯的pDCs从其他组织，包括骨髓，血液和脾脏中找到的pDCs不同的，因此，目前还不清楚PP的pDC和其他的pDC群是否发育和/或功能上相关的。具体来说，pDCs细胞被广泛称为是主要的I型干扰素（IFN）生产者造血系统中，响应Toll样受体7和9（TLR7 / 9）快速干扰素分泌1-3刺激。然而，PP的pDCs是缺乏生产型干扰素响应TLR激动剂刺激4,5。此外，聚丙烯的pDCs也从发现在骨髓和脾脏中的pDCs不同要求从类型信号I干扰素（IFN）受体（IFNAR1）或干扰素信号分子STAT1为他们的发展和/或积累5。这些数据表明，不同的监管机制，控制PP的pDCs与其他器官pDCs细胞（ 如骨髓，脾）5的可能性。
导致这一方法的发展的基本原理是基于在理解树突状细胞（DC）的生物学的最新进展。大多数，如果不是全部，DC亚群从表达该FMS-样酪氨酸激酶3受体（的Flt3）6-10造血祖细胞派生，但是，直流发展并不局限于经典的髓系和淋巴途径。例如，FLT3 +普通髓系祖细胞（中医师，林- IL-7R -的Sca-1 -的c-kit + CD34 +细胞FcγRLO / - ）来个CDP（林-的c-kit 罗 CD115 +的Flt3 +）引起，whic率进一步分化成PDC和传统的DC中心（CDC）9,10。相比之下，FLT3 +普通淋巴祖细胞（的CLP，林- IL-7R +的Sca-1 LO的c-kit LO），主要发展为pDCs细胞11。因此，以前的研究表明的pDCs产生下FLT3L的调节至少2个不同的造血祖细胞群体，虽然典型的分析已被限制在骨髓，脾脏和/或血液的pDC亚群。因此，生成聚丙烯的pDCs的祖人口（S）所需的调查。了解PP pDCs细胞的起源将揭示他们是否与其他的pDC人群有着共同的发展途径光线，或者他们这一代人在PP中使用不同的机制。
本文所述的方法的独特优点是使用，显示严重不足的PP pDCs细胞为受体的造血祖细胞的过继转移小鼠。小鼠基因抽动缺失该基因编码的IFNAR1（IFNAR - / -小鼠）或STAT1（STAT1 - / - ）揭示了PP的pDCs 5一个惊人的消耗。因此，这些菌株提供一种聚丙烯的pDCs被还原的环境，允许继转移研究，在缺少有效的细胞消融制度如致死照射来进行。这里提出的方法的另外一个优势是利用流体力学基因转移（HGT）来刺激FLT3L升高的循环量。这提供了以诱导FLT3L 体内 ，相对于注射重组蛋白的具成本效益的方法。大量的研究，包括那些在我们的实验室中，聘用HGT诱导细胞因子的量在各种实验条件5,12,13。
劳动和精确的免疫功能区议会的划分是在免疫学的主要兴趣。特别是，pDCs细胞是口服耐受和全身抗病毒的重要介质反应，但它们也似乎有助于自身免疫和癌症14-17的发展和持续性。本文所述的协议将允许调节聚丙烯的pDCs的发育机制更加充分的探讨。此外，这种方法可能会允许研究，以评估PP pDC的功能，并且可以扩展到理解中的PP其他免疫人群的调节和功能。
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Protocol
机构的批准必须提前对本文描述的所有实验操作涉及的小鼠获得。这些技术包括利用C57BL6小鼠的骨髓祖细胞的分离，IFNAR - / -小鼠为受体的造血祖细胞的过继转移和使用HGT的体内细胞因子过度表达。适当的住房及动物护理也必须由研究者或机构提供。此外，可能需要在流体动力学的基因转移（ 即重组DNA批准）中使用的质粒的机构批准。这里所描述的研究被批准的机构动物护理和使用委员会在UT MD安德森癌症中心。
1。水动力基因转移（HGT）
这一步应该提前2天个CDP的过继转移进行诱导循环FLT3L直流扩建体内 5。公关epare至少5受体小鼠/组。
- 实现高效的HGT，收件人IFNAR的血管- / -小鼠（CD45.2 +）应通过暴露小鼠的加热灯5-10分钟进行散瞳。
- 鼠标放置在一个阻挡装置和消毒其尾部，用70％的乙醇。
- 注射5微克的质粒的编码FLT3L于2ml无菌PBS到尾静脉用27号针头。对于控制队列，如上经尾静脉注射5微克空载体（PORF）的。
- 监测小鼠15-30分钟，以确保有尾静脉注射无不良影响。返回小鼠房屋公用设施专用2天。
2。从小鼠骨髓分离造血祖细胞的
这一步应该HGT术后第2天进行。使用同类系CD45.1 +小鼠骨髓祖细胞的来源过继转移到受体IFNAR - /- 动物（CD45.2 +）。在这个协议中，同源品种需要区分供体和受体衍生的DC，以及避免免疫介导的消耗由于MHC错配。约10-20小鼠将被要求为转移实验提供足够数量的造血祖细胞（10 5个细胞/受体小鼠）。
- 用CO 2窒息和颈椎脱位安乐死10同源CD45.1 +小鼠。
- 将每个胎体上的夹层托盘和消毒的腹部和腿部用70％乙醇。
- 做一个切口在中间腹部和切断通过从腹部皮肤每条腿，切割皮肤下腿的长度。
- 轻轻地从每个支腿去除皮肤和切割并从胎体去除腿在使用锋利的剪刀髋关节。
- 小心地从每个支腿的用锋利的刀片的股骨和胫骨取出肌肉。
- 清除股骨和胫骨用锋利的解剖刀的两端，并放置骨头中含有的完全RPMI培养皿（RMPI用10％热灭活的胎牛血清，1％青霉素/链霉素，1mM丙酮酸钠和50μM的β-巯基乙醇） 。
- 准备含1ml完全RPMI中，连接到27号针头的注射器。
- 插入27号针头插入股骨或胫骨的一端。通过轻轻地注入完全RPMI到骨头从股骨或胫骨冲洗骨髓。确保骨髓细胞正在从骨骼中移除，这可以通过在视觉上检测到出现浑浊排出介质来实现。
- 重复冲洗每个股骨和胫骨3倍，以彻底去除骨髓细胞。
- 通过轻轻地在培养皿上下吹打细胞3到5倍制备单细胞悬浮液。
- 通过一个40微米的细胞过滤网的骨髓细胞，将所述细胞渗出到一个新的文化视角除去碎片E盘。扰乱，通过用无菌注射器活塞年底温柔的压力出现在过滤器的任何细胞团块。
- 裂解红细胞（RBC）中存在的总的骨髓细胞悬浮液与商业的RBC裂解缓冲液根据制造商的说明进行操作。使用2毫升红细胞裂解buffer/4-6×10 7个细胞（细胞通常从一个鼠标）和5分钟，在室温温育时间。
- 通过离心制粒细胞在500×g离心4分钟，轻轻地吸出培养基，再悬浮在10ml FACS缓冲液（1×PBS +2毫摩尔EDTA +1％FBS）中，造粒的细胞通过离心分离，并轻轻抽吸洗涤洗涤骨髓细胞缓冲区。
- 重复洗涤，如在步骤2.13中所述，共洗涤2次。
3。荧光激活细胞分选术（FACS）来隔离个CDP
这一步需要一个初始阴性选择过程访问MidiMACS细胞分离和MACS LD柱，以及在FACS机器具有至少3激光器用荧光标记的抗体染色后，以净化多色祖子集。
- 在步骤2.14第二次洗涤后，计数骨髓细胞。如在步骤2.13中所述通过离心沉淀细胞，重悬在FACS缓冲液中，以达到每30微升FACS缓冲液中4×10 7个细胞的终浓度。
- 以制备细胞用于FACS，谱系阴性细胞首先通过在使用磁性珠柱色谱法从骨髓混合物除去谱系阳性细胞负选择富集技术。对于阴性选择过程中，添加1微克每下列商业大鼠抗小鼠抗体（ABS）能识别造血谱系标志物组成：CD3，CD19，CD11c的，CD11b的，和TER-119腹肌。的绝对值应当在一个容积为2微升/抗体对30微升细胞悬浮在FACS缓冲液被加入。
- 孵育的细胞悬浮液在4℃下进行30分钟。以下的温育后，如在步骤2.13中所述两次，用10ml的FACS缓冲液洗涤细胞。
- 重悬细胞，达到4×10 7 cells/40微升FACS缓冲液中的最终浓度。加入20微升的山羊抗大鼠IgG每份40微升细胞悬浮液的磁微珠。轻轻混匀孵育4℃，30分钟。如在步骤2.13中所述，用10ml的FACS缓冲液洗涤细胞。
- 悬浮高达10 8骨髓细胞于500μlFACS缓冲液。
- 加载MACS LD柱上按照制造商的说明，一MidiMACS细胞分离和预先清洗柱用2ml FACS缓冲液。
- 适用的骨髓细胞悬浮于列，装载高达5×10 8个细胞在2.5ml FACS缓冲液中。确保收集管（15毫升锥形管）放置在柱下。洗柱3次2毫升流式细胞仪缓冲/清水冲洗，并收集穿过柱子，将富集的细胞谱系阴性细胞。计数细胞在材料中洗脱（洗通）从柱中。
- 以通过FACS进行阳性选择的造血祖细胞亚群，染色细胞用下面的荧光共轭ABS：IL-7R（太平洋蓝），FLT3（PE）的Sca-1（PE.Cy7），CD115（APC）中，c-kit的（APC.Cy7）ABS，加上针对CD3，CD19，CD11c的，CD11b的，F4/80和TER119（所有标有PERCP经Cy5.5）标记的血统绝对的混合物。使用0.5-1微升各抗体在100微升的总体积。孵育细胞悬浮液在4℃下20-30分钟。
- 在2-3×10 7细胞/ ml的浓度，如步骤2.13，重悬在FACS缓冲液中所示洗涤细胞。通过一个35微米的细胞过滤帽筒筛选细胞去除细胞团块，这最后一步是至关重要的，以避免堵塞FACS机器。
- 将细胞悬浮在FACS管上流式细胞仪舞台和排序个CDP（林-的c-kit 罗 CD115 +的Flt3 +）对依据指定的标记谱的。收集在15ml试管含有5ml的完全RPMI中纯化细胞。
- 记录分选的细胞的绝对数量在FACS运行结束。在无菌PBS在步骤2.13，重悬表示过继转移实验通过离心沉淀细胞。
4。个CDP的过继转移
这一步通常是在动物设施所在的受体小鼠被收容。取决于FACS机器的位置，这可涉及将纯化的祖细胞群的运输进入动物设施之前的过继转移。祖细胞悬浮液应保持无菌和输送在冰上。
- 通过在100微升无菌PBS中，总体积稀释10 5个CDP纯化制备细胞悬浮液的注射。把细胞悬浮在连接到27号针头的注射器抽出。
- 揭露收件人IFNAR - / - +）以加热灯5-10分钟，通过尾静脉以实现高效喷射。
- 鼠标放置在一个阻挡装置和消毒其尾部，用70％的乙醇。
- 注入10 5 FACS纯化的在100μlPBS个CDP到尾静脉用27号针头。
- 监测小鼠15-30分钟，以确保有尾静脉注射无不良影响。返回小鼠的住房设施。
5。 PP的PDC和测量隔离金额
- 在7-10天以下的过继转移，安乐死的受体小鼠。轻轻地剥离开鼠标和揭露肠。
- 删除整个肠道，并将其放置在PBS浸湿的纸巾。沿着收集用细镊子和剪刀的小肠壁所有可见的PP。 C57BL6和IFNAR - / -小鼠通常有5-10 PP /鼠标，这是从发现孤立淋巴滤泡不同沿小肠18。请注意，该PPS往往结构不同，即使在同一个鼠标，所以仔细确保所有的PP被识别和解剖。
- 放置的PP在含有PBS的培养皿中，并使用镊子除去粪便。重复此步骤两次清洁的PP。
- 消化的PP与1毫克/毫升胶原酶中于50毫升10毫升1X Hank氏平衡盐溶液（HBSS）四烧瓶中，在剧烈搅拌1小时，在37℃下
- 通过过滤将消化的PP在40微米的细胞过滤和强制细胞的顶部隔间，用无菌注射器活塞。收集的PP细胞悬液15毫升锥形管。
- 通过离心分离，在500 xg离心5分钟，并重新悬浮于6ml 37％的Percoll溶液（37％的Percoll在RPMI培养基）沉淀应变PP细胞。轻轻地放在6毫升70％的Percoll溶液（70％的Percoll在RPMI培养基）将细胞悬浮液的下面，以形成的Percoll梯度步骤。
- 离心细胞20分钟一吨800 XG用离心机折断 。单核细胞会迁移到37/70％的界面。离心后，将单核细胞群应该由在界面区域小心移液被收集。沉淀收集的细胞通过离心分离并在50ml完全RPMI /洗涤的洗涤两次。大音量使用，以确保完全去除珀。
- 染色收集PP细胞与下列抗体检测，从过继转移的祖细胞（CD45.1 +）或受体小鼠（CD45.2 +）小鼠中获得的pDCs：CD45.1（APC.Cy7），CD45.2（PE 。Cy7的），表面CD11c（太平洋蓝），细胞CD11b（PERCP经Cy5.5），B220（APC）的Siglec-H（PE）和PDCA-1（FITC）ABS。流式细胞仪PP细胞的分析步骤3.9和3.10所示进行流动。识别的pDCs由他们的CD11c + CD11b的- B220 +的Siglec-H + PDCA-1 +表型。 ％的pDCs x可：绝对的pDC数目可以由下式确定TAL PP细胞数= PP pDCs细胞。
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Representative Results
我们的结果表明，该门控策略个CDP的分离从小鼠骨髓细胞（ 图1），如在协议2和图3详细说明。个CDP包括总骨髓细胞的约0.1％，和大约4-6×10 4个CDP可以从一个小鼠中分离出来。一旦过继转移，个CDP分化为pDCs细胞和CDC 10。
图1。门控策略个CDP的FACS纯化骨髓细胞从C57BL6小鼠收集。天堂阳性细胞被耗尽了ABS对系标记（CD3，CD19，细胞CD11b，CD11c的，TER119）采用MACS微珠介导的选择。富集的谱系阴性骨髓人口沾了荧光标记为ABS的CDP和系标记，并用流式细胞仪纯化，如图所示。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
以识别的PP的pDCs，我们使用一个初始正向和侧向散射设门，随后选通的CD11c +的Siglec-H +细胞（ 图2A和2B）IFNAR - / -小鼠具有显著减少的pDCs中的PP相对于野生型小鼠（ 图2B）5。相比之下，CD11c +细胞的Siglec-H - cDC上被发现在相似量在两种基因型（ 图2B）。因此，IFNAR - / -小鼠提供了一个机会来检查PP重建的pDC无致死照射5的效果。例如，过继转移的野生型个CDP成IFNAR - / -小鼠，如步骤4所述，刺激增加PP的pDCs（ 图2B）。此外，预处理FLT3L HGT（步骤1）进一步加强扩大的pDC在PPS（ 图2B），这意味着转个CDP和可能性，内源性的Flt3 +祖细胞FLT3L通过诱导PP pDCs细胞反应。这两个条件也刺激的CD11c +的Siglec-H - cDC上达，与cDC上6的发育起源是一致的。在PPS中的pDCs表达传统的pDC标志物，包括PDCA-1，的Siglec-H和B220，缺乏CD11b的（ 图2B-D）4,5。此外，从IFNAR分析的PPS - / -收到既FLT3L HGT并转移个CDP小鼠显示的pDCs的大部分（〜70％）是来自于供体（CD45.1 +）小鼠（ 图2E）。总的来说，这些数据表明，个CDP的过继转移诱导的pDC PP人口响应于体内 FLT3L介导的信号。
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图2分析PP的pDC在IFNAR的 - / - / - - 在FLT3L HGT和个CDP IFNAR 的过继转移小鼠小鼠用5微克的质粒编码FLT3L或空载体（PORF）由HGT静脉注射。两天后，10 5 FACS纯化个CDP分别通过尾静脉注射过继转移。七天后的CDP转移，PPS收集和分析的pDC的数量（A和B）。 CD11c +细胞的Siglec-H +的pDCs在收到个CDP + FLT3L HGT老鼠PDCA-1，B220（C），CD11b的（D），CD45.1和CD45.2（E）的表达进行了进一步的分析。 PDCA-1，B220和CD11b的表达模式是类似的pDC在所有3组（数据未显示）。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
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Discussion
本文所描述的过继转移技术评估个CDP到PP的pDC群在受体小鼠中有缺陷的聚丙烯的pDCs的贡献（ 例如IFNAR - / -小鼠）。在以后的实验中，这将是重要的，以评估其他祖亚群的电位在产生的PP的pDCs，特别是聚丙烯的pDCs是否从的Flt3 +的CLPs派生。这个问题是显著，因为目前还不清楚为什么PP pDCs细胞具有独特的敏感，适用于PP累计5 IFNAR-STAT1信号，而且如果PP的pDCs遵循类似的发展线索为其他器官的pDCs。
从理论上讲，这种方法也可能在缺乏在所有器官中的pDC群老鼠进行的。例如，小鼠缺乏的转录因子E2-2，PDC上的“主调节器”（ 即Tcf4的- / -小鼠），显示醒目的pDC消耗19。然而，Tcf4的- / -麦克风E是胚胎致死，从而Tcf4的- / -骨髓嵌合体小鼠将需要作为受助人的过继转移实验。但是，它仍是未知的PP的pDCs是否要照射敏感并会在Tcf4的被有效地耗尽- / -嵌合体。此外，致命的辐射对造血系统和支持基质的人口可能影响聚丙烯的pDC重建广泛的影响。因此，使用的IFNAR - / - 小鼠作为受体评估继转移祖子集的能力，以产生聚丙烯的pDCs可能被优选Tcf4的- / - 。嵌合体Stat1蛋白- / -小鼠还表现出显着的减少在PP的pDCs，并可以被用作接收者继转移研究，以研究PP的pDC发育起源5。一个警告的使用IFNAR的- / -或Stat1蛋白- / -小鼠是他们的免疫缺陷状态，WHI通道可能会影响在未知的方式PP pDC的重组或功能。因此，独立的方式来评估PP的pDC发育起源将增强信心数据的解释。
从技术上讲，它应该指出的是CDP的人口被发现在总骨髓，从而通过磁珠介导柱色谱进行FACS耗尽谱系标记物阳性细胞的非常低的频率是通过对祖细胞的高效净化重要流式细胞仪。这一步枯竭丰富谱系阴性细胞，从而降低FACS时间（和成本）为祖净化。本文所描述的消耗过程利用该组合对于每个实验谱系特异性抗体的混合物。商业谱系抗体鸡尾酒也可与可用于除去谱系阳性细胞，在这里，我们描述了混合物组成。所描述的方法的优点是其在作为适应于昼夜温差灵活性ferent消耗的目的，通过调节存在于所述混合物中的抗体。
在来自的PP单细胞悬浮液的制备方法，它以去除尽可能多的的PP尽可能周围的肠组织是重要的。这可以通过仔细解剖PP的来实现。的PPS充分消化胶原酶是一个关键的步骤，从肠道组织释放的白细胞。描述的Percoll密度梯度离心法是一种优选的方法，以从消化的聚丙烯样品富集白细胞。此外，值得注意的是，在PDC标记蛋白PDCA-1可以通过I型干扰素和其它刺激物20进行调节是重要的。因此，的Siglec-H是首选，因为一个PDC标记涉及细胞因子处理的研究。
使用HGT的具有在高度成本效益方面具有明显的优势。而FLT3L HGT被用在本研究中，其它细胞因子或可溶性因子的能力，以章乌拉特PP的pDC可以用HGT进行测试，在造血祖细胞的过继细胞转移的存在与否。然而，HGT导致持续的细胞因子的产生与转移质粒与重组细胞因子注射过程中观察到的更短暂增加，依赖于细胞因子的半衰期5,13。循环细胞因子的扩展海拔可能不会反映在紧急造血细胞或病毒感染的反应达到生理金额。这个警告应该在实验规划阶段和数据评估牢记。
在以后的工作中，PP的pDC群的选择性操作，如本文所述，可有助于在处理PP的pDC功能。 PP的pDCs是由存在于黏膜环境介质空调，都缺乏I型干扰素在TLR激活4,5生产。内Stat1蛋白重组PP的pDCs分析- / - 小鼠表现出这些CELLS有一个相对较低的能力，诱导I型干扰素后TLR9触发相对于自然产生的（未显示）的PP的pDCs，表示从转个CDP衍生PP的pDCs保留自然的pDCs的PP，至少这个属性。降低I型干扰素生产的PP的pDCs的对比与强大的I型干扰素等人群的pDC分泌和提出了关于PP的pDCs的职能作用的问题。而且，PP的pDCs类似那发展中的I型IFN，一个PDC人口示范IL-17的CD4 + T淋巴细胞（Th17细胞）的有效的刺激的存在的pDCs 5。而Th17细胞被广泛地认为是一种炎症诱导种群，它们在肠道21兼具保护和致病作用。另外，pDCs细胞已经报道调解全身耐受口服抗原15。 PP的pDCs在局部和全身免疫功能的作用是显著的兴趣，因为了解这一点可能会发现NE瓦特的方法来操纵在疾病治疗肠道免疫和炎症反应。
总之，本文提出的方法使之产生PP的pDCs造血祖亚群的发展潜力进行评估。此过程提供了小鼠重组PP pDCs细胞。因此，可以不仅用于评估PP的pDC造血起源而且对于了解PP的pDCs以肠道环境内免疫功能的贡献了这种方法。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢博士。亚历克斯格尔巴德和威廉Overwijk的流体力学基因转移的建议。这项工作是由美国国立卫生研究院（AI098099，西南），MD安德森癌症中心的表观遗传学，MD安德森中心的炎症和癌症（SSW），和RE鲍勃史密斯教育基金（HSL）的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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