Summary
इस प्रोटोकॉल FACS की मध्यस्थता सेल अलगाव, hydrodynamic जीन स्थानांतरण, और Peyer के पैच में प्रतिरक्षा सबसेट के प्रवाह विश्लेषण को शामिल तकनीकों का उपयोग, आम के वृक्ष के समान सेल progenitors से Peyer के पैच में plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं के भेदभाव का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन है.
Abstract
इस प्रोटोकॉल आंतों Peyer पैच (पीपी) में plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) उत्पन्न करने के लिए शुद्ध hematopoietic progenitors की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का विवरण. आम के वृक्ष के समान सेल progenitors (CDPs, लिन - सी किट लो CD115 + FLT3 +) FACS द्वारा C57BL6 चूहों की अस्थि मज्जा से शुद्ध और पीपी में एक महत्वपूर्ण PDC जनसंख्या की कमी है कि प्राप्तकर्ता चूहों को हस्तांतरित किया गया है, इस मामले में, Ifnar - / - चूहों स्थानांतरण प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल किया गया. कुछ चूहों में, वृक्ष के समान सेल वृद्धि कारक FLT3 ligand (Flt3L) की overexpression Flt3L एन्कोडिंग प्लाज्मिड की hydrodynamic जीन स्थानांतरण (HGT) का उपयोग कर, CDPs के हस्तांतरण के दत्तक करने से पहले लागू किया गया था. Flt3L overexpression तबादला (या अंतर्जात) hematopoietic progenitors से होने वाले डीसी आबादी बढ़ती है. पूर्वज स्थानांतरण के बाद 7-10 दिनों में, adoptively तबादला progenitors से उठता है कि पीडीसी पर प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया गयातबादला CDPs + CD45.1 जा रहा है और प्राप्तकर्ताओं CD45.2 + होने से पीडीसी साथ CD45 मार्कर अभिव्यक्ति का आधार. पीपी में PDC आबादी के लिए योगदान करने के लिए और Flt3L का जवाब करने के लिए हस्तांतरित CDPs की क्षमता प्राप्तकर्ता चूहों से पीपी एकल कक्ष निलंबन के प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था. यह विधि अन्य पूर्वज आबादी पीपी पीडीसी पैदा करने में सक्षम हैं कि क्या परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण HGT के माध्यम से परिसंचारी साइटोकिन्स जोड़ तोड़ से ख्यात विकासात्मक पहलू और / या का एक उपयुक्त पछाड़ना, पीटकर या overexpression साथ पूर्वज सबसेट स्थानांतरित करके, पीपी में PDC विकास को प्रभावित करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं कि कारकों की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . यह विधि भी पीपी पीडीसी पी पी एस में अन्य प्रतिरक्षा कैंपेन्स की आवृत्ति या कार्य प्रभावित का विश्लेषण कैसे अनुमति दे सकता है. - / - चूहों, गंभीर रूप से समाप्त पीपी पीडीसी जंगली जानवरों के सापेक्ष इस प्रकार allowi दिखा जो इस पद्धति की एक अनूठी विशेषता Ifnar का इस्तेमाल होता हैघातक विकिरण से confounding प्रभाव के अभाव में पीपी पीडीसी की एनजी पुनर्गठन.
Introduction
यहाँ, हम आम के वृक्ष के समान सेल progenitors (CDPs) Peyer पैच (पीपी) में plasmacytoid वृक्ष के समान सेल (पीडीसी) आबादी को जन्म देने में सक्षम हैं आकलन है कि एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. इस विधि का उपयोग करने का समग्र लक्ष्य Peyer पैच (पीपी पीडीसी) में पीडीसी के विकास विनियमन मूल्यांकन किया गया था. यह महत्वपूर्ण है कारण पीपी पीडीसी अस्थि मज्जा, रक्त और तिल्ली सहित अन्य ऊतकों में पाया पीडीसी से अलग है, और इसलिए यह पीपी पीडीसी और अन्य PDC आबादी developmentally और / या कार्यात्मक संबंधित हैं या नहीं यह स्पष्ट नहीं है कि है. विशेष रूप से, पीडीसी व्यापक रूप से मैं टोल की तरह रिसेप्टर 7 और तेजी IFN स्राव 1-3 से 9 (TLR7 / 9) उत्तेजना का जवाब hematopoietic प्रणाली के भीतर (IFN) उत्पादकों इंटरफेरॉन प्रिंसिपल प्रकार होने के लिए जाना जाता है. हालांकि, पीपी पीडीसी मैं TLR एगोनिस्ट उत्तेजना 4,5 के जवाब में IFN प्रकार के उत्पादन में कमी कर रहे हैं. इसके अलावा, पीपी पीडीसी भी में अस्थि मज्जा और तिल्ली में पाया पीडीसी से अलगप्रकार से संकेत की जरूरत पड़ेगी मैं (IFN) रिसेप्टर (IFNAR1) इंटरफेरॉन या IFN उनके विकास और / या संचय 5 के लिए अणु STAT1 संकेत. ये आंकड़े अलग नियामक तंत्र के अन्य अंगों में पीडीसी बनाम पीपी पीडीसी (जैसे अस्थि मज्जा, प्लीहा) 5 कि नियंत्रण संभावना का सुझाव दिया है.
इस पद्धति के विकास के लिए नेतृत्व कि औचित्य वृक्ष के समान सेल (डीसी) जीव विज्ञान को समझने में हाल के अग्रिमों पर आधारित था. ज्यादातर, नहीं तो सब, डीसी सबसेट एफएमएस की तरह tyrosine kinase 3 रिसेप्टर (FLT3) 6-10 व्यक्त कि hematopoietic progenitors से निकाले जाते हैं, लेकिन, डीसी विकास क्लासिक माइलॉयड और lymphoid रास्ते तक ही सीमित नहीं है. उदाहरण के लिए, FLT3 + आम माइलॉयड progenitors (CMPs, लिन - आईएल 7R - SCA-1 - सी किट + CD34 + FcγR लो / -) CDPs (लिन - सी किट लो CD115 + FLT3 +) को जन्म दे, जोघंटे आगे पीडीसी और पारंपरिक DCS (CDCs) 9,10 में अंतर. इसके विपरीत, FLT3 + आम lymphoid progenitors (CLPs, लिन - आईएल 7R + Sca -1 लो सी किट लो) पीडीसी 11 में मुख्य रूप से विकसित करना. इसलिए, पहले पढ़ाई ठेठ विश्लेषण अस्थि मज्जा, प्लीहा और / या रक्त PDC कैंपेन्स के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है, हालांकि पीडीसी, Flt3L के नियमन के तहत कम से कम 2 अलग hematopoietic पूर्वज आबादी से उत्पन्न होती संकेत मिलता है. इस प्रकार, पीपी पीडीसी उत्पन्न करता है कि पूर्वज आबादी (ओं) जांच की आवश्यकता है. पीपी पीडीसी के मूल को समझना वे अन्य PDC आबादी के साथ आम विकास के रास्ते का हिस्सा हैं, इस पर प्रकाश डाला, या पीपी में उनकी पीढ़ी के दौरान अलग तंत्र का उपयोग करेंगे.
यहाँ बताया दृष्टिकोण का एक अनूठा लाभ hematopoietic progenitors के दत्तक हस्तांतरण के लिए प्राप्तकर्ता के रूप में पीपी पीडीसी में एक गंभीर कमी बताते हैं कि चूहों का इस्तेमाल होता है. जीन के साथ चूहोंजीन एन्कोडिंग में टिक विलोपन IFNAR1 (Ifnar - / - चूहों) या STAT1 (Stat1 - / -) पीपी पीडीसी 5 में एक हड़ताली कमी का पता चला. इसलिए, इन उपभेदों दत्तक हस्तांतरण के अध्ययन में इस तरह के घातक विकिरण के रूप में शक्तिशाली सेल पृथक व्यवस्थाओं के अभाव में प्रदर्शन करने की अनुमति, पीपी पीडीसी कम कर रहे हैं, जिसमें एक वातावरण प्रदान करते हैं. यहाँ प्रस्तुत विधि का एक अतिरिक्त शक्ति Flt3L का ऊंचा परिसंचारी मात्रा को प्रोत्साहित करने के लिए hydrodynamic जीन स्थानांतरण (HGT) का इस्तेमाल होता है. इस पुनः संयोजक प्रोटीन के इंजेक्शन की तुलना में, विवो में Flt3L प्रेरित करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है. हमारी प्रयोगशाला में उन सहित कई अध्ययनों, प्रयोगात्मक शर्तों 5,12,13 की एक किस्म में साइटोकाइन मात्रा में उत्पन्न करने के लिए HGT कार्यरत है.
DCs के लिए श्रम और सटीक प्रतिरक्षा कार्य का विभाजन इम्यूनोलॉजी में प्रमुख ब्याज की है. विशेष रूप से, पीडीसी मौखिक सहिष्णुता और प्रणालीगत विरोधी वायरल के महत्वपूर्ण मध्यस्थोंप्रतिक्रियाओं, अभी तक वे भी औतोइम्मुिनित कैंसर 14-17 के विकास और दृढ़ता के लिए योगदान करने के लिए दिखाई देते हैं. यहाँ बताया प्रोटोकॉल पीपी पीडीसी के विनियमन के विकास तंत्र और पूरी तरह से पता लगाया जा करने की अनुमति देगा. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण पढ़ाई पीपी PDC समारोह का आकलन करने के लिए अनुमति दे सकता है, और पी पी एस के भीतर अन्य प्रतिरक्षा आबादी के विनियमन और समारोह को समझने के लिए बढ़ाया जा सकता है.
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Protocol
संस्थागत अनुमोदन चूहों को शामिल के साथ साथ वर्णित सभी प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए अग्रिम में प्राप्त किया जाना चाहिए. इन अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं के अलगाव के लिए C57BL6 चूहों का उपयोग शामिल है, Ifnar - / - दत्तक hematopoietic progenitors के हस्तांतरण और इन विवो में साइटोकाइन overexpression के लिए HGT के उपयोग के लिए प्राप्तकर्ता के रूप में चूहों. उपयुक्त आवास और जानवरों की देखभाल भी अन्वेषक या संस्था द्वारा प्रदान किया जाना चाहिए. इसके अलावा, संस्थागत अनुमोदन hydrodynamic जीन स्थानांतरण (यानी पुनः संयोजक डीएनए अनुमोदन) में इस्तेमाल किया plasmids के लिए आवश्यक हो सकता है. यहाँ वर्णित पढ़ाई केन्द्र शासित प्रदेशों के एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. Hydrodynamic जीन स्थानांतरण (HGT)
यह कदम इन विवो 5 में डीसी के विस्तार के लिए Flt3L परिसंचारी प्रेरित करने के लिए CDPs के दत्तक हस्तांतरण करने के लिए 2 दिन पहले किया जाना चाहिए. जनसंपर्कepare कम से कम 5 प्राप्तकर्ता चूहों / समूह.
- कुशल HGT को प्राप्त करने के लिए, प्राप्तकर्ता Ifnar की रक्त वाहिकाओं - / - चूहों (CD45.2 +) 5-10 मिनट के लिए एक हीटिंग दीपक को चूहों द्वारा उजागर फैली हुई किया जाना चाहिए.
- एक restrainer डिवाइस में माउस प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ अपनी पूंछ कीटाणुरहित.
- एक 27 जी सुई का उपयोग नस पूंछ में बाँझ पीबीएस के 2 मिलीलीटर में प्लाज्मिड एन्कोडिंग Flt3L की 5 ग्राम इंजेक्षन. संकेत के रूप में नियंत्रण पलटन के लिए, पूंछ नस के माध्यम से खाली वेक्टर (pORF) की 5 ग्राम इंजेक्षन.
- पूंछ नस इंजेक्शन का कोई हानिकारक प्रभाव हैं सुनिश्चित करने के लिए 15-30 मिनट के लिए चूहों पर नज़र रखें. 2 दिनों के लिए आवास की सुविधा के लिए चूहों पर लौटें.
2. माउस अस्थि मज्जा से hematopoietic progenitors के अलगाव
यह कदम 2 दिन HGT के बाद किया जाना चाहिए. प्राप्तकर्ता Ifnar में दत्तक हस्तांतरण के लिए अस्थि मज्जा progenitors के स्रोत के रूप में congenic CD45.1 + चूहों का प्रयोग करें - /- जानवरों (CD45.2 +). इस प्रोटोकॉल में, congenic उपभेदों दाता और प्राप्तकर्ता व्युत्पन्न DCs भेद करने के लिए, साथ ही कारण MHC बेमेल के लिए प्रतिरक्षा की मध्यस्थता कमी से बचने के लिए आवश्यक हैं. लगभग 10-20 चूहों हस्तांतरण प्रयोगों के लिए hematopoietic कोशिकाओं पूर्वज के लिए पर्याप्त संख्या (10 5 कोशिकाओं / प्राप्तकर्ता माउस) प्रदान करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
- सीओ 2 asphyxiation और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से 10 congenic CD45.1 + चूहों euthanize.
- एक विच्छेदन ट्रे पर प्रत्येक शव प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ पेट और पैरों बाँझ.
- मध्य पेट में एक चीरा और पैर की लंबाई नीचे त्वचा में कटौती, एक पैर को पेट से त्वचा के माध्यम से काटा.
- धीरे एक पैर से त्वचा को हटा दें, और कटौती और तेज कैंची का उपयोग कूल्हे पर शव से पैर हटा दें.
- ध्यान से एक तेज ब्लेड का उपयोग कर एक पैर की फीमर और टिबिया से मांसपेशियों को हटा दें.
- हटानादोनों एक तेज छुरी के साथ फीमर और टिबिया के सिरों और (10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट और 50 माइक्रोन β-mercaptoethanol के साथ RMPI) पूरा RPMI युक्त एक संस्कृति डिश में हड्डियों जगह .
- एक 27 जी सुई से जुड़ा पूरा RPMI के 1 मिलीलीटर युक्त एक सिरिंज तैयार करें.
- फीमर या टिबिया के एक छोर में 27 जी सुई डालें. धीरे हड्डी में पूरा RPMI इंजेक्शन द्वारा फीमर या टिबिया से अस्थि मज्जा फ्लश. कि अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की हड्डी से हटाया जा रहा है सुनिश्चित करना; इस नेत्रहीन बादलमय प्रतीत होता है कि निष्कासित मीडिया का पता लगाने के द्वारा पूरा किया जा सकता है.
- अच्छी तरह से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को दूर करने के लिए प्रत्येक फीमर और टिबिया 3x निस्तब्धता दोहराएँ.
- धीरे संस्कृति डिश में ऊपर और नीचे 3-5X कोशिकाओं pipetting द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करें.
- एक नए संस्कृतियों में जताया कोशिकाओं रखने, एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से गुजर रहा मलबा हटानेई पकवान. एक बाँझ सिरिंज सवार के अंत के साथ कोमल दबाव से झरनी पर आने वाले किसी भी सेल clumps को बाधित.
- Lyse निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक आरबीसी lysis बफर के साथ कुल अस्थि मज्जा सेल निलंबन में उपस्थित लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी). 2 मिलीलीटर आरबीसी सेल buffer/4-6 10 x 7 कोशिकाओं (एक माउस से आम तौर पर कोशिकाओं) और आरटी पर 5 मिनट के एक ऊष्मायन समय का उपयोग करें.
- (1x पीबीएस + 2 मिमी EDTA + 1% FBS), pelleting कोशिकाओं centrifugation द्वारा और धीरे धोने aspirating 10 मिलीलीटर FACS बफर में resuspending, धीरे संस्कृति के माध्यम aspirating, 500 XG पर 4 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं pelleting द्वारा अस्थि मज्जा कोशिकाओं को धो लें बफर.
- कदम 2.13 में वर्णित के रूप में 2 washes के एक कुल के लिए, धोने दोहराएँ.
3. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल CDPs पृथक छंटनी (FACS)
यह कदम, एक प्रारंभिक नकारात्मक चयन प्रक्रिया के लिए एक MidiMACS सेल विभाजक और एमएसीएस एलडी स्तंभों के लिए उपयोग की आवश्यकता हैfluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ धुंधला के बाद बहुरंगा पूर्वज सबसेट को शुद्ध करने के लिए कम से कम 3 लेज़रों के साथ ही साथ एक FACS मशीन.
- कदम 2.14 में दूसरा धोने के बाद, अस्थि मज्जा की कोशिकाओं गिनती. कदम 2.13 में वर्णित के रूप में centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं और FACS बफर के 30 μl प्रति 4 10 x 7 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए FACS बफर में resuspend.
- FACS के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, वंश नकारात्मक कोशिकाओं पहली चुंबकीय मनका कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग अस्थि मज्जा मिश्रण से वंश पॉजिटिव कोशिकाओं को हटा एक नकारात्मक चयन तकनीक से समृद्ध कर रहे हैं. CD3, CD19, CD11c, CD11b, और आतंकवाद-119 ABS के: नकारात्मक चयन प्रक्रिया के लिए, hematopoietic वंश मार्करों समझते हैं कि निम्न वाणिज्यिक चूहा विरोधी माउस एंटीबॉडी (पेट) में से प्रत्येक के 1 ग्राम जोड़ें. पेट FACS बफर में 30 μl सेल निलंबन के लिए 2 μl / अब की एक मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए.
- 30 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन सेतेमि. कदम 2.13 में वर्णित के रूप में ऊष्मायन के बाद, FACS बफर के 10 एमएल के साथ दो बार धोने कोशिकाओं.
- FACS बफर के 4 10 x 7 cells/40 μl के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं Resuspend. सेल निलंबन के प्रत्येक 40 μl प्रति बकरी विरोधी चूहा आईजीजी चुंबकीय microbeads की 20 μl जोड़ें. धीरे मिक्स और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. कदम 2.13 में वर्णित के रूप में FACS बफर के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें.
- FACS बफर के 500 μl में 10 8 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के लिए ऊपर Resuspend.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक MidiMACS सेल विभाजक पर एक एमएसीएस एलडी स्तंभ लोड और 2 मिलीलीटर FACS बफर के साथ स्तंभ prerinse.
- FACS बफर के 2.5 मिलीलीटर में 5 एक्स 10 8 कोशिकाओं को लोड, स्तंभ के लिए अस्थि मज्जा सेल निलंबन लागू करें. एक संग्रह ट्यूब (15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब) सुनिश्चित स्तंभ के तहत रखा गया है. स्तंभ FACS बफर / धोने के 2 मिलीलीटर के साथ 3x धो लें, और के लिए समृद्ध होगा जो स्तंभ, के माध्यम से पारित है कि कोशिकाओं को इकट्ठावंश नकारात्मक कोशिकाओं. स्तंभ से eluted सामग्री में कोशिकाओं (धोने के माध्यम से) गणना.
- FACS द्वारा hematopoietic पूर्वज कैंपेन्स के सकारात्मक चयन करने के लिए, निम्न fluorescently संयुग्मित पेट के साथ दाग कोशिकाओं: IL-7R (प्रशांत ब्लू), FLT3 (पीई), एससीए -1 (PE.Cy7), CD115 (एपीसी), सी किट (APC.Cy7) ABS, प्लस CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 और Ter119 (सभी PerCP Cy5.5 के साथ लेबल) के खिलाफ निर्देशित वंश मार्कर abs का एक मिश्रण. 100 μl की कुल मात्रा में प्रत्येक Ab की 0.5-1 μl का प्रयोग करें. 20-30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन सेते हैं.
- FACS बफर में कदम 2.13 और resuspend में संकेत के रूप में 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल 2-3 की एकाग्रता में कोशिकाओं को धो लें. सेल clumps को दूर करने के लिए एक 35 माइक्रोन सेल झरनी टोपी ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं तक. यह अंतिम कदम FACS मशीन clogging से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
- FACS मंच पर एक FACS ट्यूब में सेल निलंबन प्लेस और CDPs (लिन - सी किट लो CD115 + FLT3 +) छंटनी परसंकेत मार्कर प्रोफाइल के आधार. पूरा RPMI के 5 एमएल युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में शुद्ध कोशिकाओं लीजिए.
- FACS चलाने के अंत में हल कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या रिकार्ड. दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए बाँझ पीबीएस में कदम 2.13 और resuspend में संकेत के रूप में centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
4. CDPs के दत्तक हस्तांतरण
यह कदम आम तौर पर प्राप्तकर्ता चूहों रखे जाते हैं, जहां जानवरों की सुविधा में किया जाता है. FACS मशीन के स्थान पर निर्भर करता है, यह पिछले दत्तक हस्तांतरण के लिए जानवरों की सुविधा में शुद्ध पूर्वज सेल आबादी के परिवहन शामिल हो सकता है. पूर्वज सेल निलंबन बाँझ रखा और बर्फ पर ले जाया जाना चाहिए.
- 100 μl बाँझ पीबीएस की कुल मात्रा में 10 5 शुद्ध CDPs गिराए द्वारा इंजेक्शन के लिए सेल निलंबन तैयार. एक 27 जी सुई से जुड़ी एक सिरिंज में सेल निलंबन रखें.
- प्राप्तकर्ता का पर्दाफाश Ifnar - / - +).
- एक restrainer डिवाइस में माउस प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ अपनी पूंछ कीटाणुरहित.
- एक 27 जी सुई का उपयोग नस पूंछ में 100 μl पीबीएस में 10 5 FACS शुद्ध CDPs इंजेक्षन.
- पूंछ नस इंजेक्शन का कोई हानिकारक प्रभाव हैं सुनिश्चित करने के लिए 15-30 मिनट के लिए चूहों पर नज़र रखें. आवास की सुविधा के लिए चूहों पर लौटें.
5. पीडीसी की पीपी और मापन के अलगाव राशियाँ
- दत्तक हस्तांतरण निम्नलिखित 7-10 दिनों में, प्राप्तकर्ता चूहों euthanize. धीरे विच्छेदन के द्वारा माउस को खोलने और आंत का पर्दाफाश.
- पूरे आंत निकालें और पीबीएस लथपथ कागज तौलिए पर जगह है. ठीक संदंश और कैंची का उपयोग छोटी आंत की दीवार के साथ सभी दृश्य पी पी एस लीजिए. C57BL6 और Ifnar - / - चूहों आमतौर पर पाया पृथक ल्य्म्फोइड रोम से अलग हैं जो 5-10 पीपी / माउस, हैछोटी आंत 18 के साथ. पी पी एस तो ध्यान से सभी पी पी एस पहचान और विच्छेदित कर रहे हैं, यह सुनिश्चित भी एक माउस के भीतर अक्सर संरचना की दृष्टि से अलग कर रहे हैं ध्यान दें.
- पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में पी पी एस, जगह और मल को दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें. पी पी एस साफ करने के लिए दो बार इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
- एक 50 मिलीलीटर में 10 मिलीलीटर 1x हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) में 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase चतुर्थ के साथ डाइजेस्ट पी पी एस 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जोरदार सरगर्मी के साथ फ्लास्क
- एक बाँझ सिरिंज सवार के साथ झरनी के माध्यम से एक 40 माइक्रोन सेल झरनी और बल कोशिकाओं के शीर्ष कम्पार्टमेंट में पचा पीपी रखें. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पीपी सेल निलंबन लीजिए.
- 37% Percoll समाधान (RPMI मध्यम में 37% Percoll) के 6 मिलीलीटर में 5 मिनट और resuspend के लिए 500 XG पर centrifugation द्वारा तनावपूर्ण पीपी गोली कोशिकाओं. धीरे एक Percoll कदम ढाल के लिए फार्म, सेल निलंबन के नीचे (RPMI मध्यम में 70% Percoll) 70% Percoll समाधान के 6 मिलीलीटर जगह है.
- 20 मिनट के लिए एक अपकेंद्रित्र कोशिकाओंअपकेंद्रित्र बंद तोड़ने के साथ 800 XG टी. Mononuclear कोशिकाओं 37/70% इंटरफ़ेस की ओर पलायन होगा. Centrifugation के बाद, mononuclear सेल आबादी इंटरफ़ेस क्षेत्र में सावधान pipetting द्वारा एकत्र किया जाना चाहिए. गोली centrifugation द्वारा कोशिकाओं एकत्र की है और पूरा RPMI / धोने के 50 एमएल में दो बार धोने. एक बड़ी मात्रा में पूरा Percoll हटाने सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (पीई: adoptively तबादला progenitors (CD45.1 +) या प्राप्तकर्ता चूहों (CD45.2 +) से निकाले जाते हैं कि murine पीडीसी का पता लगाने के लिए निम्न एंटीबॉडी के साथ एकत्र पीपी कोशिकाओं दाग . Cy7), CD11c (प्रशांत ब्लू), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (एपीसी), Siglec एच (पीई) और PDCA -1 (FITC) ABS. कदम 3.9 और 3.10 में संकेत के रूप में पीपी कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन करना. उनके CD11c + CD11b द्वारा पीडीसी पहचानें - B220 + Siglec-एच + PDCA -1 + फेनोटाइप. % पीडीसी एक्स के लिए: निरपेक्ष PDC संख्या निम्न समीकरण द्वारा निर्धारित किया जा सकता हैताल पीपी सेल नंबर = पीपी पीडीसी.
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Representative Results
हमारे परिणाम प्रोटोकॉल 2 और 3 में विस्तृत रूप में, माउस अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से CDPs के अलगाव (चित्रा 1) के लिए gating रणनीति दिखा. CDPs कुल अस्थि मज्जा की कोशिकाओं का लगभग 0.1% शामिल है, और मोटे तौर पर 4-6 एक्स 10 4 CDPs एक माउस से अलग किया जा सकता है. दत्तक हस्तांतरण पर, CDPs पीडीसी और CDCs 10 में अंतर.
CDPs की FACS शुद्धि के लिए चित्रा 1. Gating रणनीति. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं C57BL6 चूहों से एकत्र किए गए थे. वंश पॉजिटिव कोशिकाओं वंश मार्कर (CD3, CD19, CD11b, CD11c, Ter119) एमएसीएस microbead की मध्यस्थता चयन का उपयोग कर के खिलाफ पेट के साथ समाप्त हो गया. समृद्ध वंश नकारात्मक अस्थि मज्जा जनसंख्या fluorescently लेबल एक साथ सना हुआ थासीडीपी और वंश मार्कर, और के रूप में दिखाया FACS द्वारा शुद्ध के लिए बी एस. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
पी पी एस में पीडीसी की पहचान करने के लिए, हम का उपयोग एक आगे और CD11c + Siglec एच + कोशिकाओं (आंकड़े 2A और 2 बी) के लिए gating द्वारा पीछा ओर तितर बितर gating रणनीति, प्रारंभिक Ifnar -. / - चूहों को पी पी एस सापेक्ष में पीडीसी में एक महत्वपूर्ण कमी है जंगली प्रकार चूहों (चित्रा 2 बी) 5. इसके विपरीत, CD11c + Siglec-एच द्वारा - CDCs दोनों जीनोटाइप (चित्रा 2 बी) में समान मात्रा में पाए जाते हैं. इसलिए, Ifnar - / - चूहों घातक विकिरण 5 के प्रभाव के बिना पीपी PDC पुनर्गठन की जांच के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं. उदाहरण के लिए, Ifnar में जंगली प्रकार CDPs के दत्तक हस्तांतरण - / - चूहों, चरण 4 में वर्णित है, पीपी पीडीसी (चित्रा 2 बी) में वृद्धि को उत्तेजित करता है. इसके अलावा, Flt3L HGT (चरण 1) पी पी एस (चित्रा 2 बी) में आगे बढ़ाया PDC विस्तार, तबादला CDPs और संभावना अंतर्जात FLT3 + progenitors जिसका अर्थ के साथ pretreatment पीपी पीडीसी उत्प्रेरण द्वारा Flt3L का जवाब. दोनों की स्थिति भी CD11c प्रेरित + Siglec एच - CDCs, CDCs 6 की विकासात्मक मूल के साथ संगत बराबर है. पी पी एस में पीडीसी PDCA -1, Siglec एच और B220 सहित पारंपरिक PDC मार्करों व्यक्त, और CD11b (आंकड़े 2 बी डी) 4,5 कमी है. इसके अलावा, Ifnar से पी पी एस के विश्लेषण - / - Flt3L HGT दोनों प्राप्त और CDPs तबादला कि चूहों पीडीसी के बहुमत (~ 70%) दाता (CD45.1 +) चूहों (चित्रा 2 ई) से प्राप्त किए गए हैं दिखाया. सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों CDPs के दत्तक हस्तांतरण विवो में Flt3L की मध्यस्थता संकेतों के जवाब में पीपी PDC आबादी लाती है कि प्रदर्शित करता है.
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. Ifnar में पीपी पीडीसी की चित्रा 2 विश्लेषण - / -. - / - Flt3L HGT और CDPs Ifnar के दत्तक हस्तांतरण पर चूहों चूहों प्लाज्मिड एन्कोडिंग Flt3L या HGT से एक खाली सदिश (pORF) के 5 ग्राम के साथ नसों में इंजेक्शन थे. दो दिन बाद, 10 5 FACS शुद्ध CDPs adoptively पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से स्थानांतरित कर दिया गया. सात दिनों सीडीपी स्थानांतरण पोस्ट, पी पी एस PDC मात्रा के लिए एकत्र की है और विश्लेषण किया गया (ए, बी). CDPs + Flt3L HGT प्राप्त है कि चूहों में CD11c + Siglec-एच + पीडीसी आगे PDCA -1, B220 (सी), CD11b (डी), CD45.1 और CD45.2 (ई) अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया. PDCA -1, B220 और CD11b की अभिव्यक्ति पैटर्न सभी 3 समूहों (डेटा में पीडीसी में समान था) नहीं दिखाया गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
(- / - चूहों जैसे Ifnar) वर्णित दत्तक हस्तांतरण तकनीक के साथ साथ पीपी पीडीसी में कमी कर रहे हैं कि प्राप्तकर्ता चूहों में पीपी PDC आबादी को CDPs के योगदान का आकलन किया. भविष्य प्रयोगों में, यह पीपी पीडीसी FLT3 + CLPs से निकाले जाते हैं कि क्या विशेष रूप से, पीपी पीडीसी पैदा करने में अन्य पूर्वज कैंपेन्स की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण होगा. इस सवाल पीपी पीडीसी पीपी प्रोद्भवन 5 IFNAR-STAT1 संकेतों को विशिष्ट रूप से संवेदनशील हैं क्यों यह स्पष्ट नहीं हुआ है के बाद से महत्वपूर्ण है, और पीपी पीडीसी अन्य अंगों में पीडीसी के रूप में समान विकास cues का पालन करें.
सिद्धांत रूप में, इस विधि को भी सभी अंगों में PDC आबादी की कमी है कि चूहों में प्रदर्शन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, प्रतिलेखन कारक E2-2, पीडीसी "मास्टर नियामक" में कमी के साथ चूहों (यानी Tcf4 - / - चूहों), शो हड़ताली PDC कमी 19. हालांकि, Tcf4 - / - micई घातक भ्रूण हैं, और इस तरह Tcf4 - / - अस्थि मज्जा काइमेरिक चूहों दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल करने की आवश्यकता होगी. - / - काइमेरा हालांकि, यह पीपी पीडीसी विकिरण के प्रति संवेदनशील हैं और प्रभावी ढंग से Tcf4 में समाप्त हो जाएगी, चाहे अनजान बनी हुई है. इसके अलावा, घातक विकिरण hematopoietic प्रणाली पर और पीपी PDC पुनर्गठन प्रभाव हो सकता है कि stromal आबादी समर्थन विस्तृत असर पड़ता है. इस प्रकार, Ifnar का उपयोग - / - चूहों पीपी पीडीसी उत्पन्न करने के लिए adoptively तबादला पूर्वज कैंपेन्स की क्षमता का आकलन करने के लिए प्राप्तकर्ताओं Tcf4 को पसंद किया जा सकता है - / -. काइमेरा Stat1 - / - चूहों भी पीपी पीडीसी में एक हड़ताली कमी दिखाने के लिए और दत्तक हस्तांतरण के अध्ययन के लिए प्राप्तकर्ता के रूप में नियोजित किया जा सकता है अध्ययन पीपी PDC विकास की मूल 5. / - है - या Stat1 - Ifnar का उपयोग करने के लिए एक चेतावनी / - चूहों whi, उनके immunodeficient स्थिति हैचर्चा अज्ञात मायनों में पीपी PDC पुनर्गठन या समारोह को प्रभावित कर सकता है. इस प्रकार, पीपी PDC विकास की मूल का आकलन करने के लिए स्वतंत्र दृष्टिकोण डेटा व्याख्या में आत्मविश्वास में वृद्धि होगी.
तकनीकी तौर पर, यह सीडीपी आबादी कुल अस्थि मज्जा, पूर्व FACS के लिए चुंबकीय मनका की मध्यस्थता कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा वंश मार्कर पॉजिटिव कोशिकाओं के इस प्रकार रिक्तीकरण में एक बहुत कम आवृत्ति पर पाया जाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए द्वारा पूर्वज कोशिकाओं के कुशल शुद्धि के लिए महत्वपूर्ण है FACS. इस कमी कदम पूर्वज शुद्धि के लिए कम FACS समय (और लागत) में जिसके परिणामस्वरूप, वंश नकारात्मक कोशिकाओं को समृद्ध करती. यहाँ बताया घट प्रक्रिया एक प्रयोग के लिए संयुक्त है कि वंश विशेष एंटीबॉडी का एक मिश्रण का इस्तेमाल करता. वाणिज्यिक वंश एंटीबॉडी कॉकटेल भी उपलब्ध हैं और हम का वर्णन है कि मिश्रण की जगह में वंश पॉजिटिव कोशिकाओं को हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्णित दृष्टिकोण का लाभ अलग के लिए अनुकूलनीय जा रहा है में अपने लचीलापन हैअलग रिक्तीकरण प्रयोजनों के मिश्रण में मौजूद हैं कि एंटीबॉडी का समायोजन करके.
पी पी एस से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी में, यह संभव के रूप में पी पी एस आसपास आंतों के ऊतकों के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह पी पी एस के सावधान विच्छेदन के द्वारा पूरा किया जा सकता है. Collagenase साथ पी पी एस के लिए पर्याप्त पाचन आंतों के ऊतकों से leukocytes जारी करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. वर्णित Percoll घनत्व ढाल centrifugation तकनीक पचा पीपी नमूनों से leukocytes को समृद्ध करने के लिए एक पसंदीदा तरीका है. इसके अलावा, यह PDC मार्कर प्रोटीन PDCA -1 मैं IFN प्रकार और अन्य उत्तेजनाओं 20 से विनियमित किया जा सकता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. इसलिए, Siglec एच साइटोकाइन हेरफेर शामिल अध्ययन के लिए एक PDC मार्कर के रूप में पसंद किया जाता है.
HGT का उपयोग अत्यधिक लागत प्रभावी होने के मामले में एक स्पष्ट लाभ है. Flt3L HGT इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था, जबकि अन्य साइटोकिन्स या घुलनशील कारकों की क्षमता reg कोulate पीपी पीडीसी hematopoietic progenitors के दत्तक सेल हस्तांतरण की अनुपस्थिति या उपस्थिति में, HGT उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है. हालांकि, HGT साइटोकाइन आधा जीवन 5,13 पर निर्भर है, जो पुनः संयोजक साइटोकाइन इंजेक्शन के दौरान मनाया अधिक क्षणिक बढ़ जाती है, बनाम तबादला प्लाज्मिड से साइटोकिन्स के निरंतर उत्पादन में यह परिणाम है. साइटोकाइन परिसंचारी की विस्तारित ऊंचाई आपात hematopoietic या संक्रमण प्रतिक्रियाओं के दौरान हासिल की शारीरिक मात्रा में शामिल न हो. यह चेतावनी प्रायोगिक योजना बना चरणों और डेटा के मूल्यांकन के दौरान ध्यान में रखा जाना चाहिए.
काम में भविष्य, पीपी PDC आबादी के चयनात्मक हेरफेर, इस के साथ साथ वर्णित है, पीपी PDC समारोह को संबोधित करने में सहायता कर सकते हैं. पीपी पीडीसी mucosal वातावरण में मौजूद मध्यस्थों से वातानुकूलित और मैं TLR सक्रियण 4,5 पर उत्पादन IFN प्रकार की कमी हो जाती है. Stat1 भीतर पुनर्गठन पीपी पीडीसी का विश्लेषण - / - चूहों इन CE का प्रदर्शनLLS प्राकृतिक पीपी पीडीसी के कम से कम इस संपत्ति को बनाए रखने का तबादला CDPs से व्युत्पन्न पीपी पीडीसी का संकेत है, मैं () नहीं दिखाया स्वाभाविक रूप से उत्पन्न होने वाली पीपी पीडीसी के सापेक्ष ट्रिगर TLR9 पर IFN प्रकार प्रेरित करने के लिए एक comparably कम करने की क्षमता है. मैं पीपी पीडीसी के उत्पादन IFN कम प्रकार मैं अन्य PDC आबादी का स्राव IFN मजबूत प्रकार के साथ विरोधाभासों और पीपी पीडीसी के कार्यात्मक भूमिका के बारे में सवाल उठता है. इसके अलावा, पीपी पीडीसी मैं IFN प्रकार, आईएल -17 का उत्पादन सीडी 4 + टी lymphocytes (Th17 कोशिकाओं) का कुशल उत्तेजना को दर्शाता है कि एक PDC आबादी की उपस्थिति में विकसित कि पीडीसी सदृश 5. Th17 कोशिकाओं को व्यापक रूप से एक सूजन उत्प्रेरण आबादी माना जाता है, वे आंत 21 में दोनों सुरक्षा और रोगजनक भूमिका है. उधर, पीडीसी मौखिक रूप से प्रतिजन 15 प्रशासित करने के लिए प्रणालीगत सहिष्णुता मध्यस्थता करने के लिए सूचित किया गया है. इस बिंदु को समझने के पूर्वोत्तर प्रकट हो सकता है के रूप में स्थानीय और प्रणालीगत प्रतिरक्षा में पीपी पीडीसी की भूमिका महत्वपूर्ण ब्याज की हैरोग के उपचार में आंतों प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में हेरफेर करने के लिए डब्ल्यू दृष्टिकोण.
अंत में, इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि पीपी पीडीसी पैदा करने के लिए hematopoietic पूर्वज सबसेट के विकास की क्षमता का आकलन सक्षम बनाता है. इस प्रक्रिया का पुनर्गठन पीपी पीडीसी के साथ चूहों प्रदान करता है. इस प्रकार, इस दृष्टिकोण पीपी PDC hematopoietic मूल के मूल्यांकन के लिए, लेकिन यह भी आंतों पर्यावरण के भीतर प्रतिरक्षा कार्य को पीपी पीडीसी के योगदान को समझने के लिए न केवल इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.
Acknowledgments
हम डीआरएस धन्यवाद. Hydrodynamic जीन स्थानांतरण पर सलाह के लिए एलेक्स Gelbard और विलेम Overwijk. इस काम एनआईएच (AI098099, उ.प.), कैंसर Epigenetics के लिए एमडी एंडरसन केंद्र, सूजन और कैंसर के लिए एमडी एंडरसन केंद्र (उ.प.), और फिर बॉब स्मिथ एजुकेशन फंड (एचएसएल) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
