Summary
이 프로토콜은 FACS - 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 장 Peyer의 패치 (PP)에 plasmacytoid 수지상 세포 (PDC)를 생성하는 정제 조혈 전구 세포의 기능을 분석하는 방법을 자세히 설명합니다. 공통 수상 세포 전구 세포 (CDP가 린 - C-KIT LO CD115 + FLT3 +)을 FACS로 C57BL6 마우스의 골수로부터 정제 및 PP에서 상당한 PDC 인구 부족받는 마우스에 옮겼다,이 경우 IFNAR - / - 마우스는 전송받는로서 사용 하였다. 일부 마우스에서, 수상 세포 성장 인자 FLT3 리간드 (Flt3L)의 과발현 Flt3L-인코딩 플라스미드의 유체 역학적 유전자 전달 (HGT)를 사용하여, CDP가 전송 입양 이전에 시행되었다. Flt3L 과발현이 전송 (또는 내인성) 조혈 전구 세포에서 발생하는 DC의 인구를 확장합니다. 전구 전송 후 7-10일에서, 적응 적 전송 조상에서 발생 올라가고은에받는 사람의 세포를 구별했다전송 CDP가가 + CD45.1되는 사람과받는 사람이 CD45.2의 + 인에서 올라가고있는 CD45 마커 표현의 기초. PP의 PDC 인구에 기여하고 Flt3L에 대응하는 전송 CDP가의 능력을받는 마우스의 PP 단일 세포 현탁액의 유동 세포 계측법에 의해 평가 하였다. 이 방법은 다른 전구 인구 PDCS PP를 생성 할 수 있는지 여부를 테스트하는 데 사용될 수있다. 또한,이 접근법은 HGT 통해 순환 사이토킨을 조작하여 추정 발달 요인 및 / 또는 적절한 넉다운 녹아웃 또는 과발현으로 원종 서브 세트를 전송함으로써, PP에서 PDC 발달에 영향을 미칠 것으로 예측되는 인자의 역할을 조사하기 위하여 사용될 수있다 . 이 방법은 PP의 PDC는이 보호 프로파일의 다른 면역 하위 집합의 주파수 또는 기능에 미치는 영향을 분석 할 수있다. / - - 마우스, 심각하게 고갈 PP 올라가고 야생 형 동물에 대해, 따라서 allowi을 보여이 방법의 독특한 기능은 IFNAR의 사용이다치명적인 조사에서 교란 효과의 부재에있는 PP 올라가고의 NG의 재구성.
Introduction
여기서 우리는 일반적인 돌기 세포 전구 세포 (CDP가이) Peyer의 패치 (PP)의 plasmacytoid 돌기 세포 (PDC) 인구에 상승을 줄 수 있는지 여부를 평가하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법의 전반적인 목표는 Peyer의 패치 (PP의 PDC)에 올라가고의 개발 규제를 평가하는 것이었다. 이 중요한 이유는 PP의 PDC의 골수, 혈액, 비장 등 다른 조직에서 발견 올라가고 다른, 따라서 그것이 PP의 올라가고 및 다른 PDC의 인구가 발달 및 / 또는 기능적으로 관련 있는지 불분명하다는 것이다. 구체적으로 올라가고 널리 I는 수신자 같은 수용체 7 빠른 IFN 분비 1-3 9 (TLR7 / 9) 자극에 반응, 조혈 시스템 내에서 (IFN) 생산 인터페론의 주요 유형으로 알려져있다. 그러나, PP의 올라가고 내가 TLR 길항제 자극 4,5에 대한 응답으로 IFN 유형을 생산 부족합니다. 또한, PP 올라가고는 골수와 비장에서 발견 PDC의 다른입력 신호를 필요로하는 난 (IFN) 수용체 (IFNAR1를) 인터페론 또는 IFN은 개발 및 / 또는 축적 5에 대한 분자 STAT1 신호. 이러한 데이터는 별개의 규제 메커니즘은 다른 장기에 올라가고 대 PP의 PDC는 (예를 들어, 골수, 비장) 5를 제어 가능성을 제안했습니다.
이 방법의 개발을 주도 이론적 근거는 수지상 세포 (DC) 생물학을 이해하는 최근의 진보에 근거했다. 대부분의 경우, 전부는 아니더라도, DC 부분 집합은 FMS 같은 티로신 키나제 수용체 3 (FLT3) 6-10 표현 조혈 전구 세포에서 파생되지만, DC 개발은 고전 골수성과 림프 경로에 제한되지 않습니다. 예를 들어, FLT3은 + 일반적인 골수 전구 세포 (CMP한다, 린 - IL-7R - 무서 1 - C-키트 + CD34 + FcγR LO / -) CDP가 (린 - C-키트 싸다 CD115 + FLT3 +) 일으키다, whic시간이 더 올라가고 기존의 DC (CDCS) 9,10로 분화. 대조적으로, FLT3 + 일반 림프 전구 세포 (CLP를, 린 - IL-7R + 무서-1 LO 형 c-Kit LO)은 올라가고 (11)에 주로 개발한다. 따라서, 종래의 연구는 일반적인 분석 골수, 비장 및 / 또는 혈액 PDC 서브 세트로 제한되어 있지만, PDCS는, Flt3L의 규제 하에서 적어도 두 별개의 조혈 전구 개체군에서 발생 나타낸다. 따라서, PP 올라가고을 생성하는 전구 인구 (들) 조사를 요구했다. PP 올라가고의 기원을 이해하는 것은 그들이 다른 PDC 집단과 일반적인 발달 경로를 공유하는지 여부에 있나, 또는 PP에서의 생성 중에 서로 다른 메커니즘을 활용합니다.
본원에 기재된 방법의 고유 한 이점은 조혈 전구 세포의 대체 입금받는 등 PP PDCS의 심한 결핍을 보여 생쥐의 사용이다. 유전자를 가진 쥐유전자 인코딩 TIC 삭제 IFNAR1 (IFNAR - / - 마우스) 또는 STAT1 (STAT1는 - / -) PP 올라가고 5 눈에 띄는 고갈을 공개했다. 따라서, 이들 균주를 대체 전송의 연구는 치명적인 조사 유력한 세포 절제 체제의 부재하에 수행 될 수 있도록, PP의 PDCS이 감소 된 환경을 제공한다. 여기에 제시된 방법의 추가 강도 Flt3L의 높은 순환 양을 자극하는 유체 역학적 유전자 전달 (HGT)의 사용이다. 이 재조합 단백질의 주입 대, 생체 내에서 Flt3L을 유도 할 수있는 비용 효과적인 방법을 제공합니다. 우리의 실험실을 포함하여 많은 연구, 실험 조건 5,12,13의 다양한 사이토 카인의 양을 유도 HGT를 사용했다.
DC의 노동 정확한 면역 기능의 분할은 면역학의 주요 관심입니다. 특히, PDC의 경구 관용과 조직의 항 바이러스의 중요한 매개체입니다반응은, 그러나 그들은 또한자가 면역과 암 14 ~ 17의 개발과 보존에 기여할 것으로 보인다. 여기에 설명 된 프로토콜은 PP 올라가고 조절 발달 메커니즘을 더욱 완벽하게 탐험 할 수 있습니다. 또,이 방법은 연구 PP PDC 함수를 평가할 수 있고, 프로파일 내의 다른 면역 인구의 규제와 기능을 이해하기 위해 확장 될 수있다.
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Protocol
기관 승인 마우스를 포함 여기에 설명 된 모든 실험 조작에 대해 사전에 취득해야합니다. 이들은 골수 전구 세포의 분리를위한 C57BL6 마우스의 사용을 포함, IFNAR - / - 입양 조혈 전구 세포의 이동 및 생체 내 사이토 카인의 과다 발현을위한 HGT의 사용에 대한받는 사람으로 마우스. 적절한 주거 및 동물 관리는 연구자 또는 기관에 의해 제공되어야한다. 또한, 기관 승인 유체 유전자 전달 (즉, 재조합 DNA 승인)에 사용 된 플라스미드를 위해 요구 될 수있다. 여기에 설명 된 연구는 UT MD 앤더슨 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 유체 역학 유전자 이동 (HGT)
이 단계는 생체 내 5 DC 확장을 위해 Flt3L 순환 유도하기 위해 CDP가의 입양 전송에 2 일이 전에 수행되어야한다. 홍보epare 적어도 5받는 사람 마우스 / 그룹.
- 효율적인 HGT을 달성하기 위해, 수신자 IFNAR의 혈관 - / - 마우스 (CD45.2의 +)은 5-10 분 동안 가열 램프에 마우스를 노출시킴으로써 넓혀진한다.
- 제한 기 장치에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 꼬리를 소독.
- 27 G 바늘을 사용하여 정맥 꼬리으로 멸균 PBS의 2 ㎖에 플라스미드 부호화 Flt3L 5 μg을 주입. 표시된 바와 같이 제어 코호트, 꼬리 정맥을 통해 빈 벡터 (pORF) 5 μg을 주입.
- 꼬리 정맥 주입의 해로운 효과가 없는지 확인하기 위해 15 ~ 30 분 동안 쥐를 모니터링합니다. 2 일 동안 주거 시설에 마우스를 반환합니다.
2. 마우스 골수에서 조혈 전구 세포의 분리
이 단계 2 일간 HGT 후에 수행해야합니다. 받는 사람 IFNAR에 입양 전송을 위해 골수 전구 세포의 소스로 congenic CD45.1 + 마우스를 사용합니다 - /- 동물 (CD45.2 +). 이 프로토콜에서 congenic 균주는 기증자와받는 사람 유래 수지상을 구별 할뿐만 아니라 인해 MHC 불일치로 면역 매개 고갈을 방지하기 위해 필요합니다. 대략 10-20 생쥐 전송 실험을 위해 조혈 전구 세포의 충분한 수 (10 105 세포 / 수신자 마우스)를 제공하기 위해 요구 될 것이다.
- CO 2 질식 자궁 전위에 의해 10 congenic의 CD45.1 + 쥐를 안락사.
- 절개 트레이에 각각의 도체를 삽입하고 70 % 에탄올로 복부와 다리를 소독.
- 중반 복부에 절개를하고, 다리의 길이 아래로 피부를 절단, 각 다리에 복부의 피부를 통해 잘라.
- 부드럽게 각 다리에서 피부를 제거하고, 절단 및 날카로운 가위를 사용 고관절에 시체에서 다리를 제거합니다.
- 조심스럽게 날카로운 칼날을 사용하여 각 다리의 대퇴골과 경골에서 근육을 제거합니다.
- 제거모두 날카로운 메스 대퇴골 및 경골의 말단 및 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 mM 나트륨 피루 베이트 및 50 μM의 β-메르 캅토 에탄올로 RMPI) 완전한 RPMI를 함유하는 배양 접시에서 뼈를 배치 .
- 27 G 바늘 연결된 완전한 RPMI 1 ㎖를 함유하는 주사기를 준비한다.
- 대퇴골 또는 경골의 한쪽 끝으로 27 G 바늘을 삽입합니다. 부드럽게 뼈에 완전한 RPMI를 주입하여 대퇴골 또는 경골에서 골수를 세척합니다. 즉 골수 세포가 뼈에서 분리되고 확인, 이것은 시각적으로 흐린 나타나는 추방 미디어를 검출함으로써 달성 될 수있다.
- 완전히 골수 세포를 제거하기 위해 각각의 대퇴골과 경골 3 배를 세척 반복합니다.
- 부드럽게 배양 접시에서 아래로 3 배를 세포를 피펫 팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
- 새의 cultur으로 스며 세포를 배치, 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 골수 세포를 전달하여 이물질을 제거전자 접시. 멸균 주사기 플런저의 끝이 부드러운 압력에 의해 여과기에 나타나는 세포 덩어리를 방해.
- 를 Lyse 제조사의 지침에 따라 상용 RBC 용해 완충액으로 전체 골수 세포 현탁액에 존재 적혈구 (RBC). 2 ㎖ RBC 용해 buffer/4-6 X 10 7 세포 (하나의 마우스에서 일반적 세포) 및 RT에서 5 분의 배양 시간을 사용합니다.
- (1X PBS + 2 mM의 EDTA는 + 1 % FBS), 펠렛 세포를 원심 분리하여 부드럽게 세척 흡입 10 ㎖ FACS 버퍼에 재현 탁 부드럽게 배지를 흡입, 500 XG에 4 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛으로 골수 세포를 씻으십시오 버퍼.
- 단계 2.13에서 설명한대로 2 회 세척 총 들어, 세척을 반복한다.
3. 형광 활성화 된 셀 CDP가를 분리 (FACS)를 정렬
이 단계는, 초기 네거티브 선택 절차를위한 MidiMACS 세포 분리기와 MACS LD 컬럼에 액세스해야찬란 복합 항체로 염색 한 후 여러 가지 빛깔의 전구 집합을 정화하는 적어도 3 개의 레이저와뿐만 아니라 FACS 기계.
- 단계 2.14 초 세척 후에, 골수 세포를 센다. 단계 2.13에서 설명한대로 원심 분리하여 세포를 펠릿 FACS 완충액 30 μL 당 4 × 10 7 세포의 최종 농도를 달성하기 위해 FACS 완충액를 resuspend.
- FACS를위한 세포를 제조 계보-음성 세포는 제 1 자기 비드 컬럼 크로마토 그래피를 이용하여 골수 혼합물로부터 혈통 양성 세포를 제거 네거티브 선택 기술에 의해 농축된다. CD3, CD19,의 CD11c, CD11b를, 그리고 테르-119 ABS : 음의 선택 절차, 조혈 계통의 마커를 인식하고 다음과 같은 상용 쥐 항 - 마우스 항체 (ABS)의 각 1 μg을 추가합니다. 애비는 FACS 버퍼에 30 ㎕의 세포 현탁액에 2 μL / AB의 볼륨에 추가해야합니다.
- 30 4 ° C에서 세포 현탁액을 품어분. 단계 2.13의 설명대로 배양에 이어, FACS 완충액 10 ㎖로 두 번 세포를 씻어.
- FACS 완충액으로 4 × 10 7 cells/40 μl의 최종 농도를 달성하기 위해 세포를 재현 탁. 세포 현탁액을 각각 40 μL 당 염소 항 - 쥐 IgG의 자기 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 부드럽게 섞어 30 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. 단계 2.13에 설명 된대로 FACS 버퍼 10 ㎖로 세포를 씻으십시오.
- FACS 버퍼 500 μL에 10 8 골수 세포까지를 Resuspend.
- 제조업체의 지침에 따라 MidiMACS 전지 세퍼레이터에 MACS의 LD 열을로드하고 2 ㎖의 FACS 버퍼를 사용하여 열을 사전 헹굼.
- FACS 버퍼의 2.5 ㎖에 5 × 10 8 셀을로드, 열 골수 세포 현탁액을 적용합니다. 포집 관 (15 ML 원뿔 관을) 확인은 열 아래에 배치됩니다. 열 FACS 버퍼 / 워시 2 ㎖로 3 회 씻어에 충실 할 컬럼을 통과 세포를 수집혈통 음성 세포. 컬럼에서 용출 물질의 세포를 (씻어 통해) 계산합니다.
- FACS에 의해 조혈 전구 부분 집합의 긍정적 인 선택을 수행하려면, 다음과 같은 형광 복합 애비와 얼룩 세포 : IL-7R (퍼시픽 블루), FLT3 (PE), 무서-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), C-KIT (APC.Cy7) 절대 플러스, CD3, CD19,의 CD11c, CD11b를, F4/80 및 Ter119 (모든 PerCP Cy5.5으로 표시)에 대한 감독 혈통 마커 애비의 혼합물. 100 μL의 총 부피의 각 AB의 0.5 μl를 사용합니다. 20 ~ 30 분 동안 4 ° C에서 세포 현탁액을 품어.
- FACS 완충액에서 재현 탁하고 2.13 단계에서 나타낸 바와 같이 X 10 7 세포 / ml 2-3의 농도로 세포를 씻어. 세포 덩어리를 제거하기 위해 35 μm의 셀 스트레이너 캡 튜브를 통해 세포를 필터링합니다. 이 마지막 단계는 FACS 기계를 막힘 방지하기 위해 매우 중요합니다.
- FACS의 무대에서 FACS 튜브에 세포 현탁액을 놓고 CDP가 (린 - C-키트 싸다 CD115 + FLT3 +)를 정렬에표시된 마커 프로파일의 기초. 완전한 RPMI 5 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브의 정제 된 세포를 수집합니다.
- FACS 실행의 끝 부분에 분류 세포의 절대 수를 기록한다. 입양 전송 실험을 위해 멸균 PBS의 단계 2.13에 resuspend에 표시된대로 원심 분리하여 펠렛은 세포.
4. CDP가의 입양 전송
이 단계는 일반적으로받는 쥐가 보관되어 동물 시설에서 수행됩니다. FACS 기계의 위치에 따라서는, 종래 양자 양도 동물 시설로 정제 된 선조 세포 집단의 전송을 포함 할 수있다. 전구 세포 현탁액은 멸균 보관하고 얼음에 전송해야합니다.
- 100 ㎕의 멸균 PBS의 총 부피의 10 5 정제 CDP가 희석하여 주입 세포 현탁액을 준비합니다. 27 G 바늘에 부착 된 주사기에 세포 현탁액을 놓습니다.
- 받는 사람 노출 IFNAR - / - +).
- 제한 기 장치에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 꼬리를 소독.
- 27 G 바늘을 사용하여 정맥 꼬리에 100 ㎕의 PBS에서 10 5 FACS 정제 된 CDP가 주입한다.
- 꼬리 정맥 주입의 해로운 효과가 없는지 확인하기 위해 15 ~ 30 분 동안 쥐를 모니터링합니다. 주거 시설에 마우스를 반환합니다.
5. PDC의 PP 및 측정의 분리 배합량
- 입양 전송 다음 7-10일에서받는 사람의 쥐를 안락사. 조심스럽게 절개하여 마우스를 열고 장 노출.
- 전체 창자를 제거하고, PBS에 적신 종이 타월 위에 놓습니다. 미세 집게와 가위를 사용하여 작은 창자의 벽을 따라 표시되는 모든 프로파일을 수집합니다. C57BL6 및 IFNAR - / - 마우스는 일반적으로 발견 고립 림프 여포는 다른 5-10 PP / 마우스를 가지고소장 (18)을 따라. 보호 프로파일은 너무 신중하게 모든 보호 프로파일을 식별하고 해부 보장, 단 한 번의 마우스에서 종종 구조적으로 별개합니다.
- PBS가 들어있는 페트리 접시에 프로파일을 배치하고 대변을 제거하는 집게를 사용합니다. 보호 프로파일을 청소 두 번이 절차를 반복합니다.
- 50 ㎖에서 10 ㎖ 1X 행크 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV 다이제스트 보호 프로파일은 37 ℃에서 1 시간 동안 격렬하게 교반 플라스크
- 멸균 주사기 플런저와 스트레이너를 통해 40 μm의 셀 스트레이너와 힘 세포의 상단 구획 정리 된 PP를 놓습니다. 15 ML 원뿔 관에있는 PP의 세포 현탁액을 수집합니다.
- 37 % 퍼콜 용액 (RPMI 배지에서 37 % 퍼콜) 6 ㎖에 5 분,에 resuspend 500 XG에서 원심 분리하여 변형 된 PP 세포 펠렛. 부드럽게 퍼콜 단계 구배를 형성하기 위해, 세포 현탁액 아래 (RPMI 배지에 70 % 퍼콜) 70 % 퍼콜 용액 6 ㎖를 배치.
- 20 분 원심 분리기 세포원심 분리기가 해소 800 XG를 톤. 단핵 세포는 70분의 37 % 년 인터페이스로 마이그레이션합니다. 원심 분리 후, 단핵 세포군은 계면 영역에서 조심 피펫에 의해 수집한다. 펠렛 원심 분리하여 세포를 수집하고 완전한 RPMI / 워시 50 ㎖에 두 번 씻는다. 큰 부피 퍼콜 완전한 제거를 보장하기 위해 사용된다.
- CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE : 적응 적 전송 조상 (CD45.1 +) 또는받는 마우스 (CD45.2 +)에서 파생 된 쥐 올라가고을 감지하기 위해 다음 항체와 수집 된 PP 세포를 얼룩 . Cy7)의 CD11c (퍼시픽 블루), CD11b를 (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) 및 PDCA-1 (FITC) 절대. 단계 3.9 및 3.10에 표시된 PP 세포의 유동 세포 계측법 분석을 수행합니다. 자신의 CD11c + CD11b를하여 올라가고을 확인 - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + 표현형. PDCS % 내지 x : 절대 PDC 번호는 다음 식에 의해 결정될 수있다탈 PP의 휴대폰 번호 = PP 올라가고.
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Representative Results
우리의 결과는 프로토콜 2와 3에 설명 된대로, 마우스 골수 세포에서 CDP가의 분리 (그림 1)에 대한 게이팅 전략을 보여줍니다. CDP가이 전체 골수 세포의 약 0.1 %를 포함하고, 약 4-6 × 104 CDP가 한 마우스로부터 단리 할 수있다. 입양 전송되면, CDP가이 올라가고 및 CDCS (10)로 분화.
CDP가의 FACS 정화 그림 1. 게이팅 전략. 골수 세포 C57BL6 마우스에서 수집되었다. 리니지 양성 세포는 계보 마커 (CD3, CD19, CD11b를,의 CD11c, Ter119) MACS에게 마이크로 비드 매개 선택을 사용 대해 절대로 고갈되었다. 풍부한 혈통 음성 골수 인구는 찬란 - 라벨로 염색했다CDP 및 혈통 마커와 같이 FACS로 정제에 대한 모텔. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보호 프로파일 올라가고을 식별하기 위해 사용하는 앞으로의 CD11c + Siglec-H + 세포 (그림 2A와 2B)에 대한 게이팅 다음 측 분산 게이팅 전략, 초기 IFNAR -. / - 마우스에 대한 보호 프로파일 상대적으로 올라가고있는 뜻 깊은 감소를 야생형 마우스 (도 2B) 5. 반면,의 CD11c + Siglec-H으로 - CDCS는 모두 유전자형 (그림 2B)에서 비슷한 양의에서 발견된다. 따라서, IFNAR - / - 마우스는 치명적인 조사 5 효과없이 PP PDC의 재구성을 검토 할 수있는 기회를 제공한다. 예를 들어, IFNAR에 야생형 CDP가의 대체 송금 - / - 생쥐, 단계 4에 설명 된대로 PP의 PDC (그림 2B)의 증가를 자극한다. 또한, Flt3L HGT (1 단계) 보호 프로파일 (그림 2B)에서 더욱 강화 된 PDC 확장, 전송 CDP가와 가능성 내생 FLT3 + 조상을 암시와 전처리 PP의 올라가고을 유도하여 Flt3L에 응답합니다. 두 조건도의 CD11c을 자극 + Siglec-H - CDCS는 CDCS 6의 발달 기원과 일치하는 금액. 보호 프로파일 올라가고는 PDCA-1, Siglec-H 및 B220를 포함하여 기존의 PDC 마커를 표현하고 CD11b를 (그림 2B-D) 4.5이 부족합니다. 또한, IFNAR에서 보호 프로파일 분석 - / - Flt3L HGT를 모두받은 CDP가 양도 마우스는 올라가고의 대다수 (~ 70 %)가 기증자 (CD45.1 +) 마우스 (그림 2E)에서 파생 된 것으로 나타났다. 종합적으로, 이러한 데이터는 CDP가의 입양 전송이 생체 내에서 Flt3L - 매개 신호에 대한 응답으로 PP PDC 인구를 유도하는 것을 보여줍니다.
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. IFNAR에있는 PP PDC의 그림 2 분석 - / -. / - - Flt3L HGT 및 CDP가 IFNAR의 입양 전송시 마우스 마우스는 플라스미드 인코딩 Flt3L 또는 HGT에 의해 빈 벡터 (pORF)의 5 μg 정맥 주사 하였다. 이틀 후, 10 5 FACS - 정제 CDP가은을 적응 꼬리 정맥 주사를 통해 전송했다. 일곱 일 CDP 전송을 게시, 보호 프로파일이 PDC 금액 수집 및 분석 하였다 (A, B). CDP가 + Flt3L HGT를받은 생쥐의 CD11c + Siglec-H + PDCS 더욱 PDCA-1, B220 (C), CD11b를 (D), CD45.1 및 CD45.2 (E) 발현에 대해 분석 하였다. PDCA-1, B220과는 CD11b의 발현 패턴은 모두 3 개 그룹 (데이터 올라가고있는 유사했다) 표시되지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
(- / - 마우스 예 IFNAR) 설명 입양 전송 기술은 여기에 PP 올라가고있는 불충분받는 생쥐의 PP PDC 인구에 CDP가의 기여를 평가했다. 미래의 실험에서는, PP의 PDCS는 FLT3 + CLP를 파생 여부 특히, PP의 PDCS 생성에 다른 전구 서브 세트들의 전위를 평가하는 것이 중요 할 것이다. 이 질문은 PP의 올라가고는 PP 적립 5를위한 IFNAR-STAT1 신호에 고유 민감한 이유는 불분명하게 남아 있기 때문에 중요하다, 그리고 PP의 PDC의 다른 장기에 올라가고와 유사한 발달 단서를 수행합니다.
이론적으로,이 방법은 모든 기관에서 PDC 인구 부족 생쥐에서 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 전사 인자 E2-2, PDC "마스터 조절기"의 결핍 마우스 (즉, TCF4 - / - 마우스), 쇼 눈에 띄는 PDC 고갈 19. 그러나, TCF4 - / - MIC전자는 치사 배아이며, 따라서 TCF4 - / - 골수 키메라 생쥐 입양 전송 실험 수신자로 사용될 필요가있을 것이다. / - - 키메라 그러나, PP의 PDC는이 조사에 민감하고 효과적으로 TCF4 고갈 될 수 있는지 여부를 알 수없는 남아있다. 또한, 치명적인 조사는 조혈 시스템 및 PP PDC의 재구성에 영향을 줄 수있는 기질 인구를 지원하는 다양한 효과가 있습니다. 따라서, IFNAR의 사용 - / - 마우스 PP의 올라가고을 생성하는 적응 적 전송 전구 부분 집합의 능력을 평가하기 위해받는 사람이 TCF4 선호 될 수 있습니다로 - / -. 키메라 STAT1 - / - 마우스는 또한 PP의 올라가고있는 눈에 띄는 감소를 보여 입양 전송 연구에 대한받는 사람에게로 사용될 수있다 연구 PP PDC 발달 기원 5. / - - 나 STAT1 - IFNAR의 사용에주의해야 할 점은 / - 마우스는 WHI, 그들의 면역 결핍 상태입니다CH는 알 수없는 방법으로 PP PDC의 재구성 또는 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, PP PDC 발달 기원을 평가하는 독립적 인 접근 방식은 데이터 해석에 대한 자신감을 향상시킬 것입니다.
기술적으로는 CDP 인구 전체 골수, 종래 FACS에 마그네틱 비드가 중재하는 컬럼 크로마토 그래피로 리니지 마커 - 양성 세포 따라서 공핍에서 매우 낮은 주파수에서 발견되는 것을 주목해야하는 것은 바이 전구 세포의 효율적인 정제를위한 중요 FACS. 이 고갈 단계는 전구 정화 감소 FACS 시간 (비용)의 결과로, 혈통 부정적인 세포를 풍요롭게. 본원에 기재된 파괴 절차는 각 실험에 대해 결합 계통 특이 항체의 혼합물을 이용한다. 상업 계통 항체 칵테일도 제공하고 우리가 설명하는 혼합물 대신에 혈통 양성 세포의 제거를 위해 이용 될 수있다. 기술 방식의 장점은 DIF에 대한 적응할에서의 유연성ferent 공핍 목적, 혼합물 내에 존재하는 항체를 조정 따라.
프로파일에서 단일 세포 현탁액의 제조에서, 가능한 프로파일을 둘러싼 장 조직의 한 많이 제거하는 것이 중요하다. 이는 프로파일의주의 해부에 의해 달성 될 수있다. 콜라와 프로파일의 충분한 소화 장 조직에서 백혈구를 해제하는 중요한 단계입니다. 설명 퍼콜 밀도 구배 원심 분리 기술은 소화 PP 샘플에서 백혈구를 풍부하게 사용되는 방법입니다. 또, PDC 마커 단백질 PDCA-1은 I IFN 분류 및 다른 자극 (20)에 의해 조절 될 수 있다는 것을주의하는 것이 중요하다. 따라서, Siglec-H는 사이토 카인의 조작과 관련된 연구를위한 PDC 마커로 바람직하다.
HGT의 사용이 매우 비용 효과적 측면에서 분명 장점이있다. Flt3L HGT가 본 연구에 이용되었지만, 다른 사이토 카인 또는 가용성 인자의 능력 레지 할ulate PP의 PDC의 조혈 전구 세포의 입양 셀 전송의 부재 또는 존재, HGT를 사용하여 테스트 할 수 있습니다. 그러나, HGT는 사이토 카인 반감기 5,13에 따라 재조합 사이토 카인 주입 동안 관찰보다 과도 증가, 대 전송 된 플라스미드에서 사이토 카인의 지속적인 생산을 초래한다. 사이토 카인 순환의 확장 높이 비상 조혈 또는 감염에 응답하는 동안 달성 생리 금액을 반영하지 않을 수 있습니다. 이주의해야 할 점은 실험 계획 단계 및 데이터의 평가가 진행되는 동안 마음에 보관해야합니다.
이후의 작업에서, PP PDC 인구의 선택적 조작은, 본 명세서에 기술 된 바와 같이, PP PDC 기능을 어드레싱 도울 수있다. PP의 올라가고는 점막의 환경에 존재하는 매개체에 의해 조절 내가 TLR 활성화 4,5에 생산을 IFN 유형에 불충분합니다. STAT1 내에서 재구성 PP의 PDC의 분석 - / - 마우스는 이러한 CE를 보여 주었다LLS 자연 PP 올라가고 적어도이 속성을 유지 전송 CDP가에서 파생 된 PP의 올라가고을 나타내는 I (도시하지 않음) 자연적으로 발생하는 PP에 올라가고를 기준으로 트리거 TLR9에 IFN 유형을 유도하기 위해 상대적으로 낮은 것으로 기능이 있습니다. 내가 PP 올라가고의 생산을 IFN 감소 형은 내가 다른 PDC 인구의 분비를 IFN 강력한 유형과 대조 및 PP 올라가고의 기능적 역할에 대한 질문을 제기한다. 또한, PP의 올라가고 내가 IFN 유형, IL-17을 생산하는 CD4 + T 림프구 (TH17 세포)를 효율적으로 자극을 보여줍니다 PDC 인구의 존재에 개발 올라가고 유사 5. TH17 세포가 널리 염증 유발 인구로 간주하고 있지만, 그들은 용기 (21)를 모두 보호하고 병원성 역할을합니다. 이와는 별도로, PDC의 경구 항원 (15)를 관리하는 조직의 내성을 매개하는 것으로보고되었다. 이 점을 이해하는 지점을 보여줄 수로 로컬 및 전신 면역 PP의 올라가고의 역할은 상당한 관심입니다질병 치료에 장 면역과 염증 반응을 조작하는 w 접근한다.
결론적으로, 여기에 제시된 방법은 PP의 PDC를 생성하는 조혈 전구 부분 집합의 개발 잠재력의 평가를 가능하게한다. 이 절차는 재구성 PP의 올라가고와 마우스를 제공한다. 따라서, 이러한 접근법은 PP PDC 조혈 기원을 평가할뿐만 아니라, 장내 환경 내 면역 기능에 PP의 PDCS의 기여를 이해하지에만 사용될 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 Drs에 감사드립니다. 유체 유전자 전달의 조언 알렉스 Gelbard와 빌렘 Overwijk. 이 작품은 NIH (AI098099, SSW), 암 후성 유전학의 MD 앤더슨 센터, 염증 및 암의 MD 앤더슨 센터 (SSW) 및 RE 바브 스미스 교육 기금 (HSL)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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