عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون
Summary
يصف هذا العمل طريقة جديدة لاستهداف انتقائي العضيات التحت خلوية في النباتات، ويعاير باستخدام BIORAD جين غون.
Abstract
من أجل استهداف بروتين واحد لالعضيات التحت خلوية متعددة، النباتات عادة تكرار الجينات ذات الصلة، والتعبير عن كل جينة على حدة باستخدام استراتيجيات التنظيمية المعقدة بما في ذلك الفرق المروجين و / أو متواليات إشارة. وتواجه المهندسين وعلماء الأحياء الاصطناعية الأيض المهتمين في استهداف الإنزيمات إلى عضية خاص مع التحدي: للحصول على البروتين الذي هو أن تكون مترجمة إلى عضية أكثر من واحد، ويجب على مهندس استنساخ نفس الجين عدة مرات. ويعرض هذا العمل حل لهذه الاستراتيجية: تسخير الربط البديلة للمرنا. هذه التكنولوجيا يستفيد من اليخضور وأنشأت بيروكسية استهداف تسلسل ويجمع بينهما في مرنا واحد هو أن تقسم بدلا من ذلك. يتم إرسال بعض المتغيرات لصق إلى بلاستيدات الخضراء، وبعض إلى بيروكسية، وبعض إلى العصارة الخلوية. هنا تم تصميم هذا النظام لاستهداف متعدد عضية مع الربط البديلة. في هذا العمل، وكان من المتوقع أن تكون EXPR GFPessed في بلاستيدات الخضراء، العصارة الخلوية، وبيروكسية من خلال سلسلة من تصميم بعقلانية 5 'مرنا به. هذه العلامات لديها القدرة على تقليل كمية الاستنساخ المطلوبة عند تحتاج إلى أن تتجلى في العضيات التحت خلوية متعددة الجينات مغاير. تم تصميم البناءات في العمل السابق 11، وكانت المستنسخة باستخدام جيبسون التجمع، وربط الأسلوب مستقلة الاستنساخ التي لا تتطلب الإنزيمات قيود. أدخلت البلازميدات الناتجة في نيكوتيانا benthamiana خلايا البشرة ورقة مع بروتوكول تعديل الجينات بندقية. أخيرا، لوحظت الأوراق تتحول مع المجهري متحد البؤر.
Introduction
هذا العمل هو مشروع الهندسة / البيولوجيا التركيبية التمثيل الغذائي حيث صممت الخلايا النباتية للتعبير عن البروتين مراسل في العضيات متعددة ولكن فقط مع بناء الحمض النووي واحد.
نهج واحد لاستهداف البروتينات لأكثر من موقع واحد ينطوي على استنساخ نسخ جينية متعددة، كل منها يحتوي على الببتيد توطين مختلفة. يجب إدخال كل نسخة قبل إعادة تحويل المتعاقبة، أو بدلا من ذلك، من خلال backcrossing التحويلات واحدة 1. وهذا ينطوي على الاستنساخ إضافية، ويقتصر تلو الآخر علامة التعريب في محطة.
طريقة أخرى لتوطين البروتين إلى مواقع متعددة من خلال الربط البديلة 2-5. وكتب الحمض النووي الريبي من جين واحد، ولكن يتم معالجتها نسخ مختلفة من النص بشكل مختلف، وغالبا في أكثر من طريقة واحدة لكل خلية. هذا يمكن أن يؤدي في أكثر من الحمض النووي الريبي رسول في الخلية نسخها من جين واحد. هذه MESSENGE مختلفةيمكن الرنا ص ترميز لالإسوية مختلفة من نفس البروتين، أو في حالة وجود انزياح الإطار، وهو بروتين مختلفة تماما. على الرغم من أن وصفت الربط البديلة في الأدب لسنوات عديدة، وفقط يتم توضيح آليات العمل والجهات المانحة الحفظ ولصق مواقع مستقبلات مؤخرا 6. كما ويجري وصف هذه المواقع على نحو أفضل، فإنها تفتح فرصا للهندسة.
وتواجه المهندسين الأيض النباتية مع التحدي عند التعبير عن بروتين في العضيات متعددة. لبروتين الذي هو أن تكون مترجمة إلى عضية أكثر من واحد، ويجب على مهندس استنساخ نفس الجين عدة مرات، مع كل تسلسل إشارة منفصلة توجيهها إلى عضية من الفائدة. لجين واحد في ثلاثة العضيات، وهذا هو ببساطة ثلاثة جينات. ولكن لالأيضية مسار ستة الجينات، وهذا يوسع إلى 18 الجينات، وهو جهد كبير الاستنساخ. الجمع بين متواليات توطين متعددة في، علامة جين واحد تقسم بدلا من ذلك،ificantly يقلل من هذا الجهد. على سبيل المثال، إعادة هندسة التنفس الضوئي والتوليف isoprenoid 7،8 9،10 تشمل كلا من البلاستيدات الخضراء وperoxisomes. في حالتنا نحن استغل مواقع لصق كما لوحظ في نظام thaliana نبات الأرابيدوبسيس الطبيعية الموصوفة سابقا 6. نحن أعيد تصميمه بعقلانية تسلسل مرنا مغادرة مواقع لصق الطبيعية وحدها، ولكن وضعت تسلسل التي من شأنها أن ترميز-بلاستيدات الخضراء أو العلامات التي تستهدف بيروكسية ضمن الإنترونات تقسم بدلا من ذلك (الشكل 1). البروتين المعبر عنه قد أو قد لا يكون علامة، اعتمادا على ما إذا كان رفعه ما قبل مرنا أن المشفرة على أنها إنترون (أرقام 1G و1H). لمزيد من المعلومات حول تصميم بنيات قدمت في هذا العمل، الرجاء مراجعة المقالة رفيق 11.
لأن هذا لا يزال هناك جهد كبير الاستنساخ، جيبسون التجمع، طريقة جديدة لاستنساخ بنيات الحمض النووي، هو شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في البناء. طريقة جيبسون يمكن استخدامها لأي تسلسل، بغض النظر عن المواقع تقييد (الشكل 2) 12-14. مزيج محددة من الانزيمات يسمح لخطوة واحدة، والتجمع متساوي الحرارة. في هذه الطريقة، فقد تم تصميم عدة أجزاء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل خطي بحيث يكون تسلسل تداخل ~ 50 نقطة. جيبسون التجمع مزيج إنزيم يساعد على هضم جزئيا أجزاء الحمض النووي الخطية، وفضح خيوط واحدة من متواليات مثلي. وهذه التسلسلات واحد الذين تقطعت بهم السبل جزئية إعادة صلب في خليط التفاعل، مما أدى إلى، خطوة واحدة، تسلسل مستقلة، خالية من ربط رد فعل subcloning السريع.
يصف هذا العمل 1) تصميم عقلاني يبني تقسم بدلا من ذلك للتعبير في البلاستيدات الخضراء النباتية، peroxisomes، وcytosols، 2) الاستنساخ باستخدام طريقة خالية من ربط جديدة من جيبسون التجمع، 3) إيصالها إلى خلايا نبات التبغ مع جين غون، و 4) النتائج التي تظهر استهداف عضية، كما لوحظ مع GFPومتحد البؤر المجهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، تم وصفها استراتيجيات بسيطة لإضفاء الطابع المحلي على البروتين المعدلة وراثيا واحد لمقصورات الخلوية متعددة في النباتات. كان الهدف لتصميم بناء من شأنه أن التعبير عن جين واحد في عضية أكثر من واحد في نيكوتيانا benthamiana. وتشمل استراتيجيات التصميم الرشي?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جين شين من مستشفى ماساتشوستس العام للتبرع سخي من الشتلات نيكوتيانا benthamiana. ساعد جين بوش لنا إلى حد كبير في تقديم المشورة في زراعة النباتات وإنشاء منطقة غرفة النمو. عرضت توم فيرانتي من معهد ويس مساعدة حاسمة مع المجهري متحد البؤر. فإن الكتاب أود أن أشكر بصفة خاصة دون انجبير من مستشفى بوسطن للأطفال ومعهد لويس التبرع السخي من جين غون واللوازم المرتبطة بها. وقدمت التمويل لهذا المشروع من خلال اتفاقية تعاون مع وزارة الطاقة وكالة مشاريع البحوث المتقدمة (ARPA-E جائزة # DE-000079) لنظام تقييم الأداء، JCW، وأطباء العالم، ومن خلال Chimerion التكنولوجيا الحيوية، وشركة لMJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Riferimenti
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants – coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5′- and 3′-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5′ mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
