Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun
Summary
Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun.
Abstract
Um ein einzelnes Protein, mehrere subzelluläre Organellen Ziel, Pflanzen in der Regel duplizieren die relevanten Genen und Express jedes Gen einzeln mit Hilfe komplexer Regulierungsstrategien einschließlich Differentialpromotoren und / oder Signalsequenzen. Metabolische Ingenieure und synthetische Biologen interessiert Zielenzyme zu einer bestimmten Organelle mit einer Herausforderung: ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mehrfach klonen. Diese Arbeit stellt eine Lösung für diese Strategie: Nutzung alternatives Spleißen der mRNA. Diese Technologie nutzt die Vorteile der etablierten Chloroplasten und Peroxisomen-Targeting-Sequenzen und kombiniert sie zu einem einzigen mRNA, die alternativ gespleißt wird. Einige Splice-Varianten sind mit der Chloroplasten geschickt, um einige der Peroxisomen, und einige in das Cytosol. Hier wird das System für mehrere Targeting-Organellen mit alternativem Spleißen ausgebildet. In dieser Arbeit wurde GFP erwartet werden exprEssed in den Chloroplasten, Cytosol und Peroxisomen durch eine Reihe von rational entworfenen 5 'mRNA-Tags. Diese Tags haben das Potential, die Menge der Klonierung heterologer Gene erforderlich, wenn benötigt, in mehreren subzellulären Organellen ausgedrückt reduzieren. Die Konstrukte wurden in früheren Arbeiten 11 ausgelegt und wurden mit Gibson Anordnung, eine Ligation unabhängigen Klonen Methode, die nicht Restriktionsenzyme erfordert geklont. Die resultierenden Plasmide wurden in Nicotiana benthamiana epidermale Blattzellen mit einem modifizierten Gene Gun-Protokoll eingeführt. Schließlich wurden umgewandelte Blätter mit der konfokalen Mikroskopie beobachtet.
Introduction
Diese Arbeit ist eine Stoffwechseltechnik / synthetischen Biologie-Projekt, bei Pflanzenzellen werden ausgeführt, um ein Reporterprotein in mehreren Organellen ausdrücken, aber mit nur einem einzigen DNA-Konstrukt.
Ein Ansatz, um Proteine an mehr als einem Ort gezielt beinhaltet Klonen mehrere genetische Kopien, die jeweils eine unterschiedliche Lokalisation Peptid. Jede Kopie muss durch sukzessive Rücktransformation eingeführt werden oder alternativ durch Rückkreuzung einzelnen Transformationen ein. Dies beinhaltet zusätzliche Klonen, und wird von einem Lokalisierungs Tag pro Terminus begrenzt.
Ein anderer Weg, um ein Protein zu mehreren Stellen lokalisiert ist, durch alternatives Splicing 2-5. RNA wird aus einem einzigen Gen transkribiert werden, aber verschiedene Kopien des Transkripts sind unterschiedlich in mehr als einen Weg pro Zelle verarbeitet wird, häufig. Dies kann in mehr als einer Boten-RNA in der Zelle von einem einzigen Gen transkribiert führen. Diese unterschiedlichen messenger RNAs können für verschiedene Isoformen des gleichen Proteins in dem Fall einer Leserahmen, einem anderen Protein vollständig zu kodieren, oder. Obwohl alternative Spleißen ist in der Literatur seit vielen Jahren beschrieben worden ist, die Wirkmechanismen und Donor-und Rezeptor konservierten Spleißstellen werden zur Zeit nur in jüngerer 6 erläutert. Da diese Standorte werden besser beschrieben, eröffnen sie Chancen für den Maschinenbau.
Pflanzenstoffwechsel Ingenieure mit einer Herausforderung bei der Expression eines Proteins in mehreren Organellen konfrontiert. Ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mit einer separaten Signalsequenz an die Organellen von Interesse zu klonieren mehrere Male, jedes. Für ein einzelnes Gen in drei Organellen, ist dies nur drei Gene. Aber für einen Sechs Gen Stoffwechselweg erweitert dies auf 18 Gene eine signifikante Klonen Aufwand. Die Kombination mehrerer Lokalisationssequenzen in einem einzigen, alternativ gespleißte Gen Zeichenificantly reduziert diese Anstrengung. Zum Beispiel, Re-Engineering Photorespiration 7,8 und 9,10 isoprenoiden Synthese betrifft sowohl die Chloroplasten und Peroxisomen. In unserem Fall nutzten wir Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis thaliana beobachtet zuvor beschriebenen 6. Wir rational gestaltete die mRNA-Sequenz, so dass die natürliche Spleißstellen allein, sondern platziert Sequenzen, die Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1) zu kodieren würde. Das exprimierte Protein kann oder kann nicht mit einem Tag, je nachdem, ob die prä-mRNA codiert, die es als ein Intron (Fig. 1g und 1h) ausgeschnitten. Für weitere Informationen über das Design der Konstrukte in dieser Arbeit vorgestellten, finden Sie im Artikel 11 Begleiter.
Da dies immer noch eine signifikante Anstrengung Klonen, Gibson Anordnung, ein neues Verfahren zur Klonierung von DNA-Konstrukten, uim Aufbau sed. Gibson Verfahren kann für jede Sequenz verwendet werden, unabhängig von Restriktionsstellen (Fig. 2) 12-14. Die spezifische Kombination von Enzymen erlaubt eine Ein-Schritt-, Isothermischer Zusammenbau. In diesem Verfahren werden mehrere doppelsträngige lineare DNA Teile ausgebildet sind, daß sie überlappende Sequenzen von ~ 50 bp. Die Gibson Montage Enzym-Mix teilweise verdaut die lineare DNA-Teile, Belichten Einzelstränge von homologen Sequenzen. Diese Teil einzelsträngigen Sequenzen erneut geglüht in der Reaktionsmischung, was zu einer schnellen, einem Schritt, sequenzunabhängige Ligation freien Subklonierung Reaktion.
Diese Arbeit beschreibt 1) rationale Design alternativ gespleißte Konstrukte für die Expression in Pflanzen Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol, 2), deren Klonierung mit dem neuen Ligation freie Methode von Gibson Montage, 3), deren Lieferung in Tabakblattzellen mit der Gene Gun und 4) Ergebnisse zeigen, Organellen-Targeting, als mit GFP beobachtetund konfokale Mikroskopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie werden einfache Strategien zur Lokalisierung eines einzelnen transgenen Proteins mehrere Zellkompartimente in Pflanzen beschrieben. Das Ziel war, ein Konstrukt, das Gen in mehr als einer Organelle in Nicotiana benthamiana ausdrücken würde entwerfen. Strategien sind rationale Design von GFP-basierten DNA-Konstrukte, Gibson Montage, Lieferung der Plasmide zu Blattzellen mit der Gene Gun und Beobachtung der Ergebnisse mit der konfokalen Mikroskopie.
Drei verschiedene…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Jen Sheen von Massachusetts General Hospital für die großzügige Spende von Nicotiana benthamiana Sämlinge danken. Jen Bush hat uns sehr geholfen in der Beratung in den Anbau von Pflanzen und die Einrichtung einer Wachstumskammer Region. Tom Ferrante des Wyss Institute angeboten entscheidende Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Die Autoren möchten besonders Don Ingber der Kinderklinik Boston und der Wyss-Institut für die großzügige Spende eines Gene Gun und die damit verbundenen Lieferungen danken. Die Finanzierung für dieses Projekt wurde durch eine Kooperation mit dem Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E-Award # DE-000079) für PAS, JCW und MdM durch Chimerion Biotechnology, Inc. für MJV vorgesehen ist, und.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
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