Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun
Summary
Este trabalho descreve um novo método para alvejar seletivamente organelas subcelulares nas plantas, analisadas usando o BioRad Gene Gun.
Abstract
A fim de orientar uma única proteína para várias organelas subcelulares, plantas tipicamente duplicar os genes relevantes e expressar cada gene separadamente usando estratégias regulatórias complexas, incluindo promotores diferenciais e / ou seqüências de sinais. Engenheiros metabólicas e biólogos sintéticos interessadas no direccionamento enzimas para um organelo particular, são confrontados com um desafio: Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes. Este trabalho apresenta uma solução para esta estratégia: o aproveitamento splicing alternativo do mRNA. Esta tecnologia aproveita de cloroplasto estabelecida e seqüências peroxissoma segmentação e as combina em um único mRNA que é alternativamente emendados. Algumas variantes de processamento são enviados para o cloroplasto, algum do peroxissoma, e outros para o citosol. Aqui o sistema é projetado para múltiplo organela alvo com splicing alternativo. Neste trabalho, a GFP era esperado para ser exprEssed no cloroplasto, citosol, peroxissoma e por uma série de racionalmente concebidos 5 'tags de mRNA. Estas etiquetas têm o potencial de reduzir a quantidade de clonagem necessária quando os genes heterólogos têm de ser expressos em vários organelos subcelulares. As construções foram concebidas em trabalho anterior 11, e foram clonados utilizando a montagem de Gibson, um método de clonagem independente de ligação que não necessita de enzimas de restrição. Os plasmídeos resultantes foram introduzidos na Nicotiana benthamiana células da epiderme da folha, com um protocolo modificado do gene da arma. Finalmente, as folhas transformadas foram observadas por microscopia confocal.
Introduction
Este trabalho é um projeto de engenharia biologia / sintético metabólica em que as células de plantas são projetados para expressar uma proteína repórter em várias organelas, mas com apenas uma única construção de DNA.
Uma abordagem para proteínas alvo de mais do que um local envolve múltiplas cópias genéticas de clonagem, contendo cada um péptido localização diferente. Cada cópia deve ser introduzido por sucessivas retransformação ou, alternativamente, por retrocruzamentos transforms solteiro 1. Isto envolve a clonagem adicional, e é limitada por uma etiqueta de localização por terminal.
Outra maneira para localizar uma proteína de múltiplos locais é através de splicing alternativo 2-5. O RNA é transcrito a partir de um único gene, mas cópias diferentes da transcrição são processados de maneira diferente, muitas vezes em mais do que uma maneira por célula. Isto pode resultar em mais do que um ARN mensageiro na célula transcrito a partir de um único gene. Estes messenge diferenteRNAs r pode codificar para diferentes isoformas da mesma proteína, ou no caso de uma mudança de enquadramento, uma proteína completamente diferente. Apesar de splicing alternativo foi descrito na literatura durante muitos anos, os mecanismos de acção e de doador conservada e locais de união de receptor apenas estão a ser elucidados mais recentemente 6. Como estes sites estão sendo mais bem descrito, abrem-se oportunidades para a engenharia.
Engenheiros metabólicos da planta são confrontados com um desafio ao expressar uma proteína em várias organelas. Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes, cada uma com uma sequência de sinal separado dirigindo-a para o organelo de interesse. Para um único gene em três organelas, este é simplesmente três genes. Mas, para uma via metabólica de seis genes, esta expande-se para 18 genes, um esforço significativo clonagem. Combinando várias seqüências de localização em um sinal de um único gene, alternativamente emendadosificantly reduz esse esforço. Por exemplo, fotorrespiração reengenharia 7,8 e síntese isoprenoid 9,10 envolve tanto os cloroplastos e peroxissomos. No nosso caso, se aproveitou de locais de splicing como observado em um sistema de Arabidopsis thaliana naturais descrito anteriormente 6. Nós racionalmente redesenhado a sequência de mRNA deixando os locais de splicing naturais sozinho, mas colocado sequências que codificam alvos-peroxissoma-cloroplasto ou dentro dos intrões alternativamente emendados (Figura 1). A proteína expressa pode ou não ter uma etiqueta, dependendo se o pré-ARNm que codificava foi excisada como um intrão (Figuras 1g e 1h). Para mais informações sobre o projeto das construções apresentadas neste trabalho, consulte o artigo do companheiro 11.
Porque este é ainda um esforço significativo clonagem, montagem Gibson, um novo método para a clonagem de arquétipos de ADN, é used na construção. O método de Gibson pode ser usado para qualquer sequência, independentemente de sítios de restrição (Figura 2) 12-14. A combinação específica de enzimas permite um único passo, a montagem isotérmico. Neste método, diversas peças de ADN de cadeia dupla linear são concebidos de tal modo que eles têm sequências sobrepostas de ~ 50 pb. A mistura de enzimas montagem Gibson digere parcialmente as partes de ADN lineares, expondo cadeias simples de seqüências homólogas. Estas sequências de cadeia simples parciais são re-recozido na mistura de reacção, resultando em um, de uma etapa, independente da sequência, de reacção rápida subclonagem livre de ligação.
Este trabalho descreve um) projeto racional construções alternativamente emendados para expressão em cloroplastos de plantas, peroxissomos, e citosois, 2) sua clonagem usando o novo método sem ligadura da montagem Gibson, 3) a sua entrega nas células da folha de tabaco com o gene Gun, e 4) Os resultados mostram a segmentação organelo, como observado com a GFPe microscopia confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, as estratégias simples são descritos para a localização de uma única proteína transgénica para vários compartimentos celulares em plantas. O objetivo era projetar construção que expressasse um único gene em mais de uma organela em Nicotiana benthamiana. As estratégias incluem desenho racional de construções de DNA baseado em GFP, montagem Gibson, a entrega dos plasmídeos de células da folha com o Gene Gun, e observação dos resultados com a microscopia confocal.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Jen Sheen do Hospital Geral de Massachusetts para a generosa doação de mudas de Nicotiana benthamiana. Jen Bush nos ajudou muito no conselho em cultivo de plantas ea criação de uma área de câmara de crescimento. Tom Ferrante, do Instituto Wyss ofereceu ajuda fundamental com microscopia confocal. Os autores gostaria especialmente de agradecer Don Ingber do Hospital Infantil de Boston e do Instituto Wyss para a generosa doação de um Gene Gun e suprimentos associados. O financiamento para este projeto foi fornecido por meio de um acordo de cooperação com o Departamento de Energia Projetos de Pesquisa Avançada Agência (ARPA-E Award # DE-000079) para PAS, JCW, e MdM, e através Chimerion Biotechnology, Inc. para MJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Riferimenti
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