Transient espressione genica in tabacco con all'Assemblea Gibson e Gene Gun
Summary
Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.
Abstract
Al fine di indirizzare una singola proteina a più organelli subcellulari, piante tipicamente duplicare i geni rilevanti, ed esprimono ogni gene separatamente utilizzando complesse strategie di regolamentazione, tra cui promotori differenziali e / o sequenze di segnali. Ingegneri metaboliche e biologi sintetici interessato a colpire enzimi per un particolare organello trovano ad affrontare una sfida: per una proteina che è da localizzare a più di un organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte. Si presenta una soluzione a questa strategia: sfruttando splicing alternativo dell'mRNA. Questa tecnologia sfrutta cloroplasto stabilito e dei perossisomi mira sequenze e li combina in un unico mRNA che viene alternativamente impiombata. Alcune varianti di splicing vengono inviati al cloroplasto, alcuni al perossisoma, e alcuni al citosol. Qui il sistema è progettato per multipli organello targeting con splicing alternativo. In questo lavoro, GFP si aspettava di essere espressed nei cloroplasti, citosol, e perossisomi da una serie di razionalmente progettati 5 'tag mRNA. Questi tag hanno il potenziale per ridurre la quantità di clonazione necessaria quando i geni eterologhi devono essere espressi in più organelli subcellulari. I costrutti sono stati progettati in opera precedente 11, e sono stati clonati usando Gibson assembly, un metodo di clonazione indipendente legatura che non richiede enzimi di restrizione. I plasmidi risultanti sono stati introdotti in Nicotiana benthamiana celle foglia epidermica con un protocollo Gene Gun modificato. Infine, foglie trasformate sono state osservate con microscopia confocale.
Introduction
Questo lavoro è un progetto di ingegneria / biologia sintetica metabolica in cui le cellule vegetali sono progettati per esprimere una proteina reporter in diversi organelli ma solo con un singolo costrutto di DNA.
Un approccio per proteine bersaglio a più di una posizione comporta clonazione più copie genetiche, ciascuna contenente un diverso peptide localizzazione. Ogni copia deve essere introdotto da successive ritrasformazione, o, in alternativa, da backcrossing singole trasformazioni 1. Ciò comporta la clonazione supplementare, ed è limitata da un tag di localizzazione per ogni terminale.
Un altro modo per localizzare una proteina a più riprese è attraverso splicing alternativo 2-5. RNA è trascritto da un singolo gene, ma diverse copie della trascrizione sono trattati in modo diverso, spesso in più di un modo per cella. Ciò può comportare più di un RNA messaggero nella cella trascritto da un singolo gene. Questi diversi messengeRNA R possono codificare per diverse isoforme della stessa proteina, o nel caso di un frameshift, una proteina diversa. Sebbene splicing alternativo è stato descritto in letteratura per molti anni, i meccanismi di azione e donatore conservati e splice siti recettoriali sono solo stati chiariti più recente 6. Poiché questi siti vengono meglio descritti, si aprono opportunità per l'ingegneria.
Gli ingegneri metaboliche delle piante si trovano ad affrontare una sfida quando esprime una proteina in più organelli. Per una proteina che è da localizzare a più organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte, ciascuno con una sequenza segnale separato dirigendolo al organello di interesse. Per un singolo gene in tre organelli, questo è semplicemente tre geni. Ma per una via metabolica sei gene, questo si espande a 18 geni, un notevole sforzo di clonazione. La combinazione di più sequenze di localizzazione in un unico segno gene alternativa-impiombatoriduce ificantly questo sforzo. Ad esempio, re-engineering fotorespirazione 7,8 e sintesi isoprenoide 9,10 coinvolge sia i cloroplasti e perossisomi. Nel nostro caso abbiamo approfittato dei siti di splicing come osservato in un sistema di Arabidopsis thaliana naturale descritto in precedenza 6. Abbiamo razionalmente riprogettato la sequenza di mRNA di lasciare i siti di splicing naturali solo, ma messo sequenze che codificano tag-perossisomi rivolti-cloroplasto o all'interno introni alternativamente-splicing (Figura 1). La proteina espressa può o non può avere un tag, a seconda che il pre-mRNA che codifica è stato escisso come un introne (Figure 1g e 1h). Per ulteriori informazioni sulla progettazione dei costrutti presentati in questo lavoro, vedere l'articolo compagna 11.
Perché questo è ancora uno sforzo significativo clonazione, il montaggio Gibson, un nuovo metodo di clonazione costrutti di DNA, è used in costruzione. Il metodo Gibson può essere utilizzato per qualsiasi sequenza, indipendentemente siti di restrizione (Figura 2) 12-14. Il mix specifico di enzimi permette un solo passaggio, assemblaggio isotermica. In questo metodo, più parti a doppio filamento lineare di DNA sono progettati in modo tale che essi hanno sequenze sovrapposte di ~ 50 bp. L'assemblaggio miscela enzimatica Gibson digerisce parzialmente le parti di DNA lineari, esponendo singoli filamenti di sequenze omologhe. Questi parziali sequenze a singolo filamento sono ri-ricotti nella miscela di reazione, con un conseguente rapido, one-step, sequenza-indipendente, reazione subcloning privo di legatura.
Questo lavoro descrive 1) progettazione razionale costrutti splicing alternativo per l'espressione di cloroplasti delle piante, perossisomi, e citosol, 2) la loro clonazione utilizzando il nuovo metodo privo di legatura di riunione Gibson, 3) la loro consegna nelle cellule delle foglie di tabacco con Gene Gun, e 4) I risultati mostrano il targeting organelli, come osservato con GFPe microscopia confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, strategie semplici sono descritti per la localizzazione di una singola proteina transgenica a più compartimenti cellulari nelle piante. L'obiettivo era di progettare costrutto che esprimesse un singolo gene in più di un organello in Nicotiana benthamiana. Le strategie includono progettazione razionale di base di GFP-costrutti di DNA, il montaggio Gibson, la consegna dei plasmidi a celle foglia con il Gene Gun, e l'osservazione dei risultati con microscopia confocale.
<p class="jo…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Jen Sheen del Massachusetts General Hospital per la generosa donazione di piantine di Nicotiana benthamiana. Jen Bush ci ha aiutato molto nella consulenza in coltivazione di piante e la creazione di una zona di camera di crescita. Tom Ferrante dell'Istituto Wyss offerto aiuto cruciale con microscopia confocale. Gli autori desiderano soprattutto ringraziare Don Ingber del Children Hospital di Boston e l'Istituto Wyss per la generosa donazione di una pistola Gene e relative forniture. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito attraverso un accordo di cooperazione con il Dipartimento dell'Energia Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) per la PAS, JCW, e MdM, e attraverso Chimerion Biotechnology, Inc. per MJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Riferimenti
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