ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן
Summary
עבודה זו מתארת את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.
Abstract
על מנת למקד את החלבון יחיד לאברונים subcellular מרובים, צמחים בדרך כלל לשכפל את הגנים הרלוונטיים, ולהביע את כל גן בנפרד באמצעות אסטרטגיות רגולציה מורכבות כולל יזמים ההפרש ו / או רצפי אות. מהנדסי חילוף חומרים וביולוגים סינטטיים מעוניינים במיקוד אנזימים לאברון בפרט מתמודדים עם אתגר: לחלבון שהוא להיות מקומי כדי אברון יותר מפעם אחת, המהנדס חייב לשכפל אותו הגן מספר פעמים. עבודה זו מציגה פתרון לאסטרטגיה זו: רתימת שחבור חלופי של mRNA. טכנולוגיה זו מנצלת הכלורופלסט הוקם ורצפי peroxisome מיקוד ומשלבת אותם לתוך mRNA יחיד שאיחה לחלופין. גרסאות אחוי חלקם נשלחו להכלורופלסט, כמה לperoxisome, וחלק לcytosol. הנה המערכת מיועדת למרובה אברון מיקוד עם שחבור חלופי. בעבודה זו, היה צפוי GFP להיות expressed בהכלורופלסט, cytosol, וperoxisome על ידי סדרה של 5 תגי mRNA 'נועדו באופן רציונלי. יש תגים אלה את הפוטנציאל להפחית את כמות הדרושה בעת שיבוט גנים Heterologous צריכים לבוא לידי ביטוי באברונים subcellular מרובים. המבנים עוצבו בעבודה קודמת 11, והיו משובטים באמצעות ההרכבה גיבסון, שיטת שיבוט עצמאית קשירה שאינו דורשת אנזימי הגבלה. פלסמידים התוצאה הוכנסו לתוך תאי עלה אפידרמיס ניקוטיאנה benthamiana עם פרוטוקול ג'ין אקדח שונה. לבסוף, עלים הפכו נצפו עם מיקרוסקופיה confocal.
Introduction
עבודה זו היא פרויקט הנדסי / ביולוגיה סינתטית מטבולים שבי תאי צמח שהונדסו חלבון כתב באברונים מרובים אבל עם רק לבנות DNA בודד.
גישה אחת כדי למקד את החלבונים למיקום אחד או יותר כרוכה בעותקים מרובים שיבוט גנטיים, המכיל פפטיד לוקליזציה שונה. כל עותק חייב להיות מוצג על ידי retransformation רצוף, או לחלופין, על ידי backcrossing התמרות אחת 1. זה כרוך בשיבוט נוסף, והוא מוגבל על ידי תג לוקליזציה אחד לתחנה סופית.
דרך נוספת בתרגום חלבון למקומות רבים היא באמצעות שחבור חלופי 2-5. RNA הוא עיבד מגן יחיד, אך עותקים שונים של התמליל מעובדים בצורה שונה, לעתים קרובות בצורה יותר מפעם אחת לכל תא. זה יכול לגרום לRNA שליח יותר מפעם אחת בתא עיבד מגן יחיד. Messenge שונה אלהRNAs r יכול לקודד לisoforms שונה של אותו החלבון, או במקרה של frameshift, חלבון אחר לגמרי. למרות ששחבור חלופי כבר תואר בספרות במשך שנים רבות, את מנגנוני פעולה ותורמים שימור אתרים ואחוי קולט הם רק שהובהרו לאחרונה 6. האתרים אלה נמצאים בתארו טובים יותר, הם נפתחים הזדמנויות להנדסה.
מהנדסים מטבולי צמח מתמודדים עם אתגר כשלבטא חלבון באברונים מרובים. לחלבון שהוא להיות מקומי כדי אברון יותר מפעם אחת, המהנדס חייב לשכפל אותו הגן מספר רב של פעמים, כל אחד עם רצף אות נפרד לכוון אותו לאברון של עניין. לגן יחיד בשלושה אברונים, זה פשוט שלושה גנים. אבל למסלול מטבולים של שישה גנים, זה מתרחב ל18 גנים, מאמץ שיבוט משמעותי. שילוב של רצפי לוקליזציה מרובים לתוך סימן יחיד, לחלופין-איחה גןificantly מפחית את המאמץ הזה. לדוגמא, photorespiration הנדסה מחדש 7,8 וסינתזת isoprenoid 9,10 כרוך הן כלורופלסטים וperoxisomes. במקרה שלנו לקחנו את היתרון של אתרי אחוי כפי שנצפה במערכת thaliana ארבידופסיס טבעית שתואר לעיל 6. אנחנו באופן רציונלי מחדש את רצף ה-mRNA עוזב את אתרי אחו הטבעיים בלבד, אלא להציב רצפים שמקודדים הכלורופלסט או תגי מיקוד peroxisome בתוך אינטרונים לחלופין-איחו (איור 1). החלבון לידי ביטוי עשוי או לא עשוי להיות תג, תלוי אם מראש mRNA שמקודד אותו היה נכרת כאינטרון (1G דמויות ו1H). לקבלת מידע נוסף על העיצוב של המבנים שהוצגו בעבודה זו, עיין במאמר הנלווה 11.
בגלל זה הוא עדיין מאמץ משמעותי שיבוט, הרכבה גיבסון, שיטה חדשה לשיבוט בונה DNA, הוא used בבנייה. שיטת גיבסון יכולה לשמש לכל רצף, ללא קשר לאתרי הגבלה (איור 2) 12-14. התערובת הספציפית של אנזימים מאפשרת לצעד אחד, הרכבה בידוד תרמית. בשיטה זו, מספר חלקי DNA ליניארי פעמיים תקועים הם תוכננו כך שיש להם רצפים חופפים של ~ 50 נ"ב. תערובת אנזים ההרכבה גיבסון באופן חלקי מעכלת את חלקי DNA ליניארי, חושף גדילים בודדים של רצפים הומולוגיים. רצפים חד גדילים החלקיים אלה מחדש annealed בתערובת התגובה, וכתוצאה מצעד אחד,, תגובה מהירה, רצף עצמאי ללא קשירה subcloning.
עבודה זו מתארת 1) מבני שחבור לחלופין תכנון רציונלים לביטוי בכלורופלסטים צמח, peroxisomes, וcytosols, 2) השיבוט שלהם תוך שימוש בשיטה ללא קשירה החדשה של ההרכבה גיבסון, 3) המשלוח שלהם לתאים עלה טבק עם אקדח הגן, ו 4) תוצאות מראים מיקוד אברון, כפי שנצפה עם ה-GFPומיקרוסקופיה confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אסטרטגיות פשוטות מתוארות לאיתור חלבון מהונדס בודד לתאים סלולריים מרובים בצמחים. המטרה הייתה לתכנן מבנה שיבטא את הגן יחיד באברון יותר מפעם אחת בbenthamiana Nicotiana. אסטרטגיות כוללות תכנון רציונלים של בונה DNA מבוסס ה-GFP, הרכבה גיבסון, משלוח של פלסמידים לתאים עלה ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לג'ן שין של בית החולים כלליים מסצ'וסטס לתרומה הנדיבה של שתילי Nicotiana benthamiana. ג'ן בוש עזר לנו מאוד בייעוץ בגידול צמחים והקמת אזור חדר צמיחה. טום פראנטה של מכון Wyss הציעה את העזרה מכרעת עם מיקרוסקופיה confocal. המחברים מבקש להודות במיוחד לדון אינגבר של בית החולים לילדים בבוסטון ומכון Wyss לתרומתו הנדיבה של אקדח גן והציוד נלווה. מימון לפרויקט זה סופק באמצעות הסכם שיתוף פעולה עם משרד אנרגיה של סוכנות לפרויקטי מחקר מתקדם (ARPA-E פרס # DE-000,079) לPAS, JCW, וMDM, ובאמצעות Chimerion ביוטכנולוגיה, Inc לMJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Riferimenti
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants – coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5′- and 3′-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5′ mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
