गिब्सन विधानसभा और जीन गन का उपयोग तंबाकू में क्षणिक जीन एक्सप्रेशन
Summary
इस काम के चुनिंदा BioRad जीन बंदूक का इस्तेमाल assayed, पौधों में subcellular organelles को निशाना बनाने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है.
Abstract
कई subcellular organelles के लिए एक प्रोटीन को लक्षित करने के लिए, पौधों आम तौर पर प्रासंगिक जीन नकल, और अंतर प्रमोटरों और / या संकेत दृश्यों सहित जटिल विनियामक रणनीतियों का उपयोग कर एक अलग जीन व्यक्त करते हैं. मेटाबोलिक इंजीनियरों और एक विशेष organelle एंजाइमों को निशाना बनाने में रुचि सिंथेटिक जीव एक चुनौती के साथ सामना कर रहे हैं: एक से अधिक organelle के लिए स्थानीयकृत किया जा रहा है कि एक प्रोटीन के लिए, इंजीनियर एक ही जीन कई बार क्लोन चाहिए. यह काम इस रणनीति के लिए एक समाधान प्रस्तुत करता है: mRNA की वैकल्पिक splicing दोहन. यह तकनीक स्थापित क्लोरोप्लास्ट और peroxisome को लक्षित दृश्यों का लाभ लेता है और वैकल्पिक रूप से spliced है कि एक एकल mRNA में उन्हें जोड़ती है. कुछ ब्याह वेरिएंट cytosol को peroxisome करने के लिए कुछ है, और कुछ, क्लोरोप्लास्ट के लिए भेजा जाता है. यहाँ प्रणाली कई organelle वैकल्पिक splicing साथ लक्षित करने के लिए बनाया गया है. इस काम में, GFP expr होने की उम्मीद थीतर्क से बनाया गया 5 'mRNA टैग की एक श्रृंखला द्वारा क्लोरोप्लास्ट, cytosol, और peroxisome में essed. ये टैग heterologous जीन कई subcellular organelles में व्यक्त करने की आवश्यकता है जब आवश्यक क्लोनिंग की मात्रा को कम करने की क्षमता है. निर्माणों पिछले काम 11 में डिजाइन किए गए थे, और गिब्सन विधानसभा, प्रतिबंध एंजाइमों की आवश्यकता नहीं है कि एक बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग विधि का उपयोग क्लोन किया गया. परिणामी plasmids एक संशोधित जीन गन प्रोटोकॉल के साथ निकोटियाना benthamiana एपिडर्मल पत्ता कोशिकाओं में शुरू किए गए थे. अंत में, तब्दील पत्ते confocal माइक्रोस्कोपी के साथ मनाया गया.
Introduction
इस काम संयंत्र कोशिकाओं कई अंगों में एक संवाददाता प्रोटीन व्यक्त इंजीनियर लेकिन केवल एक ही डीएनए का निर्माण के साथ कर रहे हैं जिसमें एक चयापचय इंजीनियरिंग / सिंथेटिक जीव विज्ञान परियोजना है.
एक से अधिक स्थान पर प्रोटीन लक्ष्य के लिए एक दृष्टिकोण क्लोनिंग कई आनुवंशिक प्रतियां, एक अलग स्थानीयकरण पेप्टाइड युक्त प्रत्येक शामिल है. प्रत्येक प्रतिलिपि एकल रूपांतरण 1 backcrossing करके, वैकल्पिक रूप से लगातार retransformation द्वारा शुरू की, या किया जाना चाहिए. इस अतिरिक्त क्लोनिंग शामिल है, और टर्मिनस प्रति एक स्थानीयकरण टैग द्वारा सीमित है.
कई स्थानों के लिए एक प्रोटीन स्थानीयकरण करने के लिए एक और तरीका है वैकल्पिक splicing 2-5 के माध्यम से है. शाही सेना के एक जीन से लिखित है, लेकिन प्रतिलेख के विभिन्न प्रतियां सेल प्रति एक से अधिक रास्ते में अक्सर अलग ढंग से कार्रवाई कर रहे हैं. यह एक जीन से लिखित सेल में एक से अधिक दूत शाही सेना में परिणाम कर सकते हैं. ये अलग messengeआर RNAs ही प्रोटीन के विभिन्न isoforms के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना, या एक frameshift, कुल मिलाकर एक अलग प्रोटीन के मामले में कर सकते हैं. वैकल्पिक splicing कई वर्षों के लिए साहित्य में वर्णित किया गया है, कार्रवाई और संरक्षित दाता और रिसेप्टर ब्याह साइटों के तंत्र केवल अधिक हाल ही में 6 elucidated किया जा रहा है. इन साइटों बेहतर वर्णित किया जा रहा है के रूप में, वे इंजीनियरिंग के लिए अवसर खुले.
कई अंगों में एक प्रोटीन व्यक्त जब संयंत्र चयापचय इंजीनियरों एक चुनौती के साथ सामना कर रहे हैं. एक से अधिक organelle के लिए स्थानीयकृत किया जा रहा है कि एक प्रोटीन के लिए, इंजीनियर ब्याज की organelle करने निर्देशन में एक अलग संकेत अनुक्रम के साथ, एक ही जीन प्रत्येक कई बार क्लोन चाहिए. तीन अंगों में किसी एक जीन के लिए, यह केवल तीन जीन है. लेकिन एक छह जीन चयापचय मार्ग के लिए, यह 18 जीन, एक महत्वपूर्ण क्लोनिंग प्रयास करने के लिए फैलता है. एक एकल, वैकल्पिक रूप से, spliced जीन हस्ताक्षर में कई स्थानीयकरण दृश्यों का मेलificantly इस प्रयास को कम करता है. उदाहरण के लिए, फिर से इंजीनियरिंग photorespiration 7,8 और isoprenoid संश्लेषण 9,10 क्लोरोप्लास्ट और पेरोक्सिज़ोम दोनों शामिल है. एक प्राकृतिक Arabidopsis thaliana प्रणाली में मनाया के रूप में हमारे मामले में हम पहले 6 वर्णित ब्याह साइटों का फायदा उठाया. हम तर्क से अकेले प्राकृतिक ब्याह साइटों छोड़ने mRNA अनुक्रम बदल दिया, लेकिन वैकल्पिक रूप-spliced introns (चित्रा 1) के भीतर क्लोरोप्लास्ट या peroxisome लक्ष्य टैग सांकेतिक शब्दों में बदलना होगा कि दृश्यों रखा. व्यक्त प्रोटीन या यह इनकोडिंग कि पूर्व mRNA एक intron (आंकड़े 1G और 1) के रूप में excised गया था पर निर्भर करता है, एक टैग नहीं हो सकता है. इस काम में प्रस्तुत निर्माणों के डिजाइन पर अधिक जानकारी के लिए, साथी अनुच्छेद 11 देखें.
यह अभी भी एक महत्वपूर्ण क्लोनिंग प्रयास, गिब्सन विधानसभा, डीएनए निर्माणों क्लोनिंग के लिए एक नई विधि है, क्योंकि यू हैनिर्माण में sed. गिब्सन विधि की परवाह किए बिना प्रतिबंध साइटों (चित्रा 2) के 12-14 की, किसी भी दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एंजाइमों के विशिष्ट मिश्रण एक एक कदम, इज़ोटेर्माल विधानसभा के लिए अनुमति देता है. इस विधि में, कई डबल असहाय रैखिक डीएनए भागों वे 50 बीपी ~ की ओवरलैपिंग दृश्य है कि इस तरह डिजाइन किए हैं. गिब्सन विधानसभा एंजाइम मिश्रण आंशिक रूप मुताबिक़ दृश्यों के एक किस्में उजागर रैखिक डीएनए भागों हज़म. ये आंशिक एकल असहाय दृश्यों एक तेजी से, एक कदम, अनुक्रम स्वतंत्र, बंधाव मुक्त subcloning प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया मिश्रण में फिर से annealed रहे हैं.
इस काम संयंत्र क्लोरोप्लास्ट, पेरोक्सिज़ोम, और cytosols में अभिव्यक्ति के लिए 1) तर्कसंगत डिजाइन वैकल्पिक रूप से spliced निर्माणों का वर्णन, 2) उनके क्लोनिंग गिब्सन विधानसभा के नए बंधाव से मुक्त विधि का उपयोग, 3) जीन गन के साथ तम्बाकू पत्ती कोशिकाओं में उनके वितरण, और GFP के साथ मनाया के रूप में, organelle लक्ष्यीकरण दिखा 4) के परिणामऔर confocal माइक्रोस्कोपी.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, सरल रणनीति पौधों में कई सेलुलर डिब्बों को एक भी ट्रांसजेनिक प्रोटीन स्थानीयकृत के लिए वर्णित हैं. लक्ष्य निकोटियाना benthamiana में एक से अधिक organelle में एक जीन व्यक्त होता है कि निर्माण करने क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों निकोटियाना benthamiana पौधों की उदार दान के लिए मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के जेन शीन को धन्यवाद देना चाहूंगा. जेन बुश पौधों बढ़ रही है और एक विकास कक्ष क्षेत्र की स्थापना में सलाह में बहुत मदद की. WYSS संस्थान के टॉम Ferrante confocal माइक्रोस्कोपी के साथ महत्वपूर्ण मदद की पेशकश की. लेखकों विशेष रूप से बच्चों के अस्पताल के बोस्टन की डॉन Ingber और एक जीन बंदूक और संबद्ध आपूर्ति के उदार दान के लिए WYSS संस्थान को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना के लिए अनुदान पीए, JCW, और मध्याह्न भोजन के लिए ऊर्जा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी विभाग (ARPA-ई पुरस्कार # DE-000079) के साथ एक सहकारी समझौते के माध्यम से प्रदान की जाती है, और Chimerion जैव प्रौद्योगिकी, Inc के माध्यम से MJV के लिए किया गया था.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Riferimenti
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