マウスにおける流体力学的遺伝子送達によるタンパク質の一過性発現
Summary
流体力学的遺伝子送達による裸のDNAのin vivoトランスフェクションは、最小限の炎症反応と動物の組織に遺伝子を導入しています。遺伝子産物の十分な量は、遺伝子の機能および調節、ならびにタンパク質の構造および機能を分析することができるように生成される。
Abstract
インビボでの導入遺伝子の効率的な発現は、遺伝子機能を研究および疾患のための治療法を開発する上で極めて重要である。過去数年にわたり、流体力学的遺伝子送達（HGD）はげっ歯類に導入遺伝子を提供するための、簡単、迅速、安全かつ効果的な方法として浮上している。この技術は、灌流臓器の細胞膜の透過性を増加させ、従って、細胞内にDNAを送達するために生理的溶液の大量の急速注入が発生する力に依拠している。 HGDの主な利点の一つは、裸のプラスミドDNA（pDNAの）を用いて哺乳動物細胞に導入遺伝子を導入する能力である。プラスミドを用いて外来遺伝子を導入することは最小限に、高効率、面倒で、ウイルスのキャリアに反して、格段に安全である。 HGDが最初にマウスに遺伝子を送達するために使用された、現在では、マウスへのオリゴヌクレオチド、人工染色体、RNA、タンパク質および小分子を含む広範囲の物質を送達するために使用され、ラットそして、限られた程度に、他の動物。このプロトコルは、マウスではHGDについて説明し、成功した手順を実行するに不可欠な方法の3つの重要な側面に焦点を当てています。正しい静脈への針の挿入、注入量および配信の速度。例は、分泌、霊長類特異的タンパク質をコードする2つの遺伝子の一過性発現にこの方法を適用することを示すために与えられて、アポリポタンパク質のLI（APOL-I）およびハプトグロビン関連タンパク質（HPR）。
Introduction
によるその最初の記述以来、Liu らとZhang ら 、流体力学的遺伝子送達（HGD）は、齧歯類モデル系1、2における遺伝子機能を研究するための貴重なツールとなっています。技術は、標的器官1,2,3の細胞によるプラスミドDNAの取り込みを容易にするために、マウスの尾静脈に大量の溶液（8〜12％の体重）の急速注入（5-7秒）を含む。これらの条件は、肝臓におけるロバストな遺伝子発現および腎臓、脾臓、肺および心臓におけるより少ない遺伝子発現をもたらす。
10のpCMV-LacZのプラスミドの注射はHGD日1に、最も効率的、非ウイルス、in vivoでの遺伝子送達方法作り、肝細胞の40％をトランスフェクトすることができます。ウイルス担体とは異なり、pDNAの準備が容易であり、齧歯類宿主3において免疫応答を誘発しないと終了と再結合することにより健康リスクをもたらすものではないogenousウイルス。 HGDにより送達DNA分子は、パッケージングを必要としないので、また、この方法は、150キロバイト4と大きい細菌人工染色体（BAC）の送達に適している。流体力学的方法によって送達されている他のタイプの分子は、RNA 384-768、モルホリノ11、タンパク質12、13および他の小分子12、14を含む。その他の配送方法を超えるHGDの長所と短所は、文献15から20に優れたレビューで議論されてきたと著者数が21〜23の手順の詳細な説明を提供してきました。
HGDでマウスに導入遺伝子を導入することは、安全で1-3、24有効であり、この方法は、同等の成功を25としたラットで使用されています。ある種の改変で、概念実証実験は、ニワトリ26にRABが行われているビット27と豚28は 、あるが、より大きな動物ではこの技術のin vivoでの適用は課題である。この方法を使用する場合、別の一般的な制限は、利用可能な哺乳動物発現ベクターの多くは、遺伝子発現の持続性の、高レベルを達成するための構成要素を欠いていることである。のpCMV-Lucのプラスミドを用いて、標的臓器における遺伝子発現がHGD後10分早ければ明らかであるが、当初、高発現レベルは、注射の1の後の最初の週に急激に低下する。長期の導入遺伝子発現は、しかしながら、高レベルの遺伝子発現の維持は、多くの場合、反復注射を必要とするプラスミドのデザイン3,24で用いられるプロモーターおよびイントロンに応じて可能である。このため、HGDは、タンパク質またはタンパク質産物を損傷への長期暴露の結果である慢性疾患を研究するのにはあまり適しかもしれない。これらの制限で、HGDはPOを研究するための例外的に強力なツールです。インビボでの遺伝子およびその変異体の効果、並びに治療効果およびタンパク質および疾患の動物モデルを確立するための調節の役割tential（総説については、15を参照）。例えば、HGD、個別にそれぞれの遺伝子をノックアウトしたマウスに種々の遺伝子構築物を導入することにより、ドメインおよびタンパク質のアミノ酸に機能を割り当てるために使用されてもよい。さらに、この技術は、任意のマウス株において使用され得る。
配達の静脈、注入量と速度に正しい針の挿入：このプロトコルは、成功したトランスフェクションを達成するために必要な技術的な側面に焦点を当てたマウスではHGDについて説明します。この方法の適用は、アフリカトリパノソーマ症のマウスモデル、ヒトおよび家畜29の致命的な病気、30に示されている。トリパノソーマのいくつかの種は、家畜の病気の原因となるが、ほとんどは、Bで免疫複合体を生得によるヒトに疾患を引き起こすことはできません100dは呼ばトリパノソーマ溶解性因子（TLFS）29、31、32。 。HPR、トリパノソーマにTLFSの取り込みを促進するリガンド、およびAPOL-I、溶解成分の31、33-38 トリパノソーマ ：これらの孔形成、高密度リポタンパク質（HDL）が2ユニークな、霊長類特異的なタンパク質が含まれているローデシアはに結合し、人間APOL-I 34、39を中和する血清耐性関連タンパク質（SRA）の発現のためにヒトに感染することができます。ヒヒTLFは、その発散APOL-Iタンパク質40に、SRAによって中和されていません。哺乳動物発現ベクター（pRG977）を使用して、以前に報告されたように、マウスにおけるヒヒTLF成分のトランスジェニック発現は、ヒト感染性トリパノソーマ40に対する防御を付与する。ここに提示代表的なデータは、遺伝子送達は、タンパク質の治療効果を研究するために適用することができる流体力学的方法を示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
正しく実行すると、HGD、導入遺伝子の送達が著しく安全で有効な手段である。成功HGDへの重要なステップは、以下のとおりです。1）未満8秒でマウス3）の尾静脈に）生理食塩水車両2の大容量で、DNAの適切な量を提供する。
注射自体のプロセスは紛れもなく、いくつかの手先の器用さが必要ですが、この6秒の手続きの成功は、多くの場合、実験の入念な準備にある。最大…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは当初、私たちの技術の様々な面での彼の継続的な指導のためHGD技術及び博士ラッセルトムソン（アルバート·アインシュタイン医科大学）教えるための夏の劉（リジェネロン）に感謝。この作品は、ニューヨーク市立資金を起動し、NSFのパン賞IOS-1249166、ハンターカレッジによって資金を供給された。我々は、マウスの肝臓での組織学のためにNYULMC組織病理コアNYUCIセンターサポートグラント、NIH / NCI 5 P30CA16087-31に感謝します。
Materials
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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