Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Summary

Na transfecção in vivo de ADN nu por entrega de genes hidrodinâmico apresenta genes no tecido de um animal com uma resposta inflamatória mínima. Uma quantidade suficiente de produto do gene são gerados de tal forma que a função do gene e regulação, bem como a estrutura e função da proteína pode ser analisado.

Abstract

Expressão eficiente de transgenes in vivo é de fundamental importância no estudo da função dos genes e desenvolvimento de tratamentos para doenças. Nos últimos anos, a entrega do gene hidrodinâmico (HGD) surgiu como um método simples, rápido, seguro e eficaz para a entrega de transgenes em roedores. Esta técnica baseia-se na força gerada pela rápida injecção de um grande volume de solução fisiológica para aumentar a permeabilidade das membranas celulares dos órgãos perfundidos e assim entregar o ADN em células. Uma das principais vantagens de HGD é a capacidade para introduzir os transgenes em células de mamíferos usando o DNA de plasmídeo despido (ADNp). A introdução de um gene exógeno usando um plasmídeo é minimamente trabalhoso, altamente eficiente e, ao contrário de transportadores virais, notavelmente segura. HGD foi inicialmente utilizado para entregar genes em ratos, é agora usado para proporcionar uma vasta gama de substâncias, incluindo oligonucleótidos, cromossomas artificiais, ARN, proteínas e pequenas moléculas em ratinhos, ratazanase, num grau limitado, de outros animais. Este protocolo descreve HGD em ratos e se concentra em três aspectos-chave do método que são fundamentais para realizar o procedimento com sucesso: correta inserção da agulha na veia, o volume de injeção ea velocidade de entrega. Os exemplos são apresentados para mostrar a aplicação deste método para a expressão transitória de dois genes que codificam para proteínas secretadas, primatas-específica, apolipoproteína LI (APOL-I) e proteína relacionada com haptoglobina (HPR).

Introduction

Desde sua primeira descrição por Liu et al. E Zhang et al., Entrega gene hidrodinâmico (HGD) tornou-se uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene em roedores sistemas modelo ^{1, 2.} A técnica envolve a injecção rápida (5-7 segundos) de um grande volume (8-12% de peso corporal) de solução para a veia da cauda dos ratinhos a fim de facilitar a absorção de ADN de plasmídeo por as células de órgãos alvo ^{1, 2.} Estas condições conduzem a expressão do gene robusto no fígado e menos expressão do gene no rim, baço, pulmão e coração.

A injecção de 10 ug de pCMV-LacZ plasmídeo pode transfectar tanto como 40% dos hepatócitos, tornando HGD o mais eficiente, não-viral in vivo, o método de entrega de genes para ^uma data. Ao contrário dos portadores virais, pDNA é fácil de preparar, não provocar uma resposta imunológica no hospedeiro roedor ³ e não representa um risco para a saúde por meio da recombinação com finalvírus ogenous. Além disso, uma vez que as moléculas de ADN entregue por HGD não precisa de embalagem, este método é adequado para a entrega de cromossomas artificiais bacterianos (BAC) tão grandes como 150 kb ^4. Outros tipos de moléculas que foram entregues por um método de hidrodinâmica incluem ARN ^5-10, morfolinos ^11, proteínas de ^{12, 13} e outras moléculas pequenas, ^{12, 14.} As vantagens e desvantagens de HGD sobre outros métodos de entrega tem sido discutido em excelentes revisões na literatura ^15-20 e um número de autores fornecida uma descrição detalhada do procedimento ^21-23.

Introduzindo transgenes em murganhos por HGD é segura e eficaz ^{1-3, 24} e o método tem sido utilizado com sucesso em ratos comparáveis ^​​25. Com certas modificações, as experiências de prova-de-conceito foram realizadas em ²⁶ galinhas, rabBits ²⁷ e ²⁸ porcos, embora, a aplicação vivo no da técnica em animais maiores continua a ser um desafio. Ao utilizar este método, uma outra limitação é comum que muitos dos vectores de expressão de mamíferos disponíveis não possuem os componentes para realizar um persistente, elevado nível de expressão do gene. Usando um plasmídeo, a expressão do gene de pCMV-Luc em órgãos alvo é evidente tão cedo quanto 10 minutos após HGD, no entanto, o elevado nível inicial, a expressão cai drasticamente, na primeira semana após a injecção ^1. A expressão do transgene a longo prazo, é possível, dependendo do promotor e o intrão utilizado na criação do plasmídeo ^{3, 24} injecções no entanto, a manutenção da expressão de genes de alto nível geralmente requer repetidas. Por esta razão, HGD pode ser menos adequado para estudar doenças crônicas, que são resultado de exposição a longo prazo às proteínas prejudiciais ou produtos de proteína. Com estas limitações, HGD é uma ferramenta extremamente poderosa para estudar a pocial papel de um gene e o efeito de que os mutantes in vivo, bem como os efeitos terapêuticos e regulação de proteínas e para o estabelecimento de modelos animais da doença (para uma revisão, ver ^15). Por exemplo, HGD pode ser utilizado para designar uma função de domínios e aminoácidos de proteínas através da introdução de várias construções de gene individualmente em ratinhos que têm os respectivos genes batido para fora. Além disso, esta técnica pode ser usada em qualquer estirpe de ratinho.

Este protocolo descreve HGD em ratos com um foco sobre os aspectos técnicos necessários para alcançar a transfecção de sucesso: a inserção da agulha correta para a veia, o volume de injeção e velocidade de entrega. A aplicação deste método é demonstrado em um modelo do rato da tripanossomíase Africano, uma doença fatal dos seres humanos e de animais ^{29, 30.} Enquanto várias espécies de tripanossomas causar doenças em animais, a maioria não pode causar a doença em humanos devido à inata complexos imunes em blood chamados fatores líticas tripanossomas (Tlfs) ^{29, 31, 32.} Estes, lipoproteínas de alta densidade que formam poros (HDL) contêm dois, proteínas primatas específicas exclusivas:. HPR, o ligante, o que facilita a captação de FPTs em tripanossomas e APOL-I, o componente lítica ^{31, 33-38} Trypanosoma brucei rhodesiense é capaz de infectar seres humanos, devido à expressão de uma proteína associada a resistência soro (SRA), que se liga e neutraliza humano APOL-I ^{34, 39.} Babuíno TLF não é neutralizado por SRA, devido à sua divergente APOL-I da proteína ^40. Como relatado anteriormente, utilizando um vector de expressão de mamífero (pRG977), a expressão transgénica do babuíno componentes TLF em ratinhos confere protecção contra tripanossomas humanos-infeccioso ^40. Os dados representativos aqui apresentados demonstram como a entrega do gene hidrodinâmico pode ser aplicado para estudar os efeitos terapêuticos de uma proteína.

Protocol

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso do Hunter College, Universidade da Cidade de Nova York. 1. Preparação de ADN plasmídico sem endotoxinas Escolha de uma única colónia de bactérias, contendo o gene de interesse num vector de expressão de mamífero a partir de uma placa recentemente riscada selectiva. Siga as recomendações encontradas no manual de um kit disponível comercialmente purificação plasm?…

Representative Results

O posicionamento correcto da agulha na veia da cauda do rato (conforme ilustrado na Figura 1) é um pré-requisito para o sucesso de entregar um transgene através de transfecção à base de hidrodinâmica. Muitas vezes, a parte mais difícil da técnica, no entanto, é a retenção da agulha dentro da veia da cauda, ​​sem movimento, de modo que todo o volume de injecção pode ser entregue dentro de um período de 6-8 s. Os pequenos erros durante o processo de injeção pode resultar em muito redu…

Discussion

Quando realizada corretamente, HGD é um meio extremamente eficaz e segura de entrega transgene. Os passos críticos para o sucesso do HGD são: 1) fornecer a quantidade certa de ADN em um grande volume de veículo salino 2) na veia da cauda do rato 3) em menos de 8 segundos.

Embora o próprio processo de injecção inegavelmente requer alguma destreza manual, o sucesso deste procedimento de seis segunda encontra-se frequentemente em uma preparação cuidadosa da experiência. A quantidade d…

Materials

Alcohol Prep Wipe	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetric	AAT Bioquest	13801
Conical Tube, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Mouse Tail Illuminator	Braintree Scientific	MTI RST	Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (mammalian expression vector)	Regeneron Pharmaceuticals		Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira	Fisher	NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip	BD	309657	Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD