Кратковременная экспрессия белков гидродинамическими доставки генов у мышей
Summary
В естественных условиях трансфекции голой ДНК по доставке гидродинамического гена вводит генов в ткани животного с минимальными воспалительной реакции. Достаточное количество продукта гена генерируются таким образом, что функция гена и регулирование, а также структура и функции белка могут быть проанализированы.
Abstract
Эффективное выражение трансгенов в естественных условиях имеет решающее значение в изучении функции генов и разработке методов лечения заболеваний. За последние годы, доставка гидродинамическая ген (HGD) стала простым, быстрым, безопасным и эффективным методом для доставки трансгенов в грызунов. Этот метод основан на силы, создаваемой быстрой инъекции большого объема физиологического раствора, чтобы увеличить проницаемость клеточных мембран перфузии органов и, таким образом доставки ДНК в клетки. Одним из основных преимуществ HGD является возможность вводить трансгенов в клетках млекопитающих с использованием обнаженной плазмидной ДНК (плазмидной). Представляя экзогенный ген с помощью плазмиды, минимально трудоемким, высокой эффективностью и, в отличие от вирусных носителей, удивительно безопасным. HGD изначально предназначался для доставки генов в организм мышей, в настоящее время используется для доставки широкого спектра веществ, в том числе олигонуклеотидов, искусственных хромосом, РНК, белков и малых молекул в мышей, крыси, в ограниченной степени, другие животные. Этот протокол описывает HGD у мышей и фокусируется на трех ключевых аспектах метода, имеют решающее значение для выполнения процедуры успешно: правильно введения иглы в вену, объем инъекции и скорость доставки. Приведены примеры, чтобы показать применение этого метода к временной экспрессии двух генов, которые кодируют секретируемые, приматов-специфических белков, аполипопротеина Л.И. (APOL-я) и гаптоглобина, связанных белка (HPR).
Introduction
С момента своего первого описания по Лю и др.., И Чжан и др.., Доставка гидродинамическая ген (HGD) стала бесценным инструментом для изучения функции генов в грызунов модельных систем 1, 2. Методика включает в быстрой инъекции (5-7 сек) большого объема (8-12% массы тела) раствора в хвостовую вену мышей, чтобы облегчить поглощение плазмидной ДНК на клетках органов-мишеней 1, 2. Эти условия приводят к надежной экспрессии генов в печени и менее экспрессии генов в почках, селезенке, легких и сердце.
Инъекция 10 мкг PCMV-LacZ плазмиды могут трансфекции целых 40% гепатоцитов, что делает HGD наиболее эффективным, невирусный, в естественных условиях способ доставки гена на сегодняшний день 1. В отличие от вирусных носителей, пДНК легко приготовить, не вызывает иммунного ответа у хозяина грызунов 3 и не представляют опасности для здоровья по рекомбинации с концаogenous вирусы. Кроме того, поскольку молекулы ДНК, поставляемые HGD не нужно упаковывать, этот метод подходит для доставки бактериальных искусственных хромосом (BAC) такого размера, как 150 кб 4. Другие типы молекул, которые были завезены гидродинамического способа включают РНК 5-10, Morpholinos 11, белки, 12, 13 и другие малые молекулы 12, 14. Преимущества и недостатки HGD по сравнению с другими методами доставки были обсуждены в превосходных отзывов в литературе 15-20 и ряд авторов предоставили подробное описание процедуры 21-23.
Представляя трансгены в мышах HGD является безопасным и эффективным 1-3, 24 и метод был использован у крыс с сопоставимой успеха 25. С некоторыми изменениями, доказательство правильности концепции эксперименты были проведены в кур 26, Раббиты 27 и свиней 28, хотя, естественных применение в этой техники в более крупных животных остается проблемой. При использовании этого метода, еще одним распространенным ограничением является то, многие из доступных векторов экспрессии млекопитающих не хватает компонентов для достижения постоянного, высокий уровень экспрессии генов. Использование плазмиды экспрессии генов, PCMV-Luc в органы-мишени, очевидно еще в десять минут после HGD, однако, первоначальный, высокий уровень экспрессии резко падает в течение первой недели после инъекции 1. Долгосрочный трансгенная экспрессия можно в зависимости от промоутера и интрона, используемого в плазмиды конструкции 3, 24 однако, поддержание экспрессии генов высокого уровня часто требует повторных инъекций. По этой причине, HGD может быть менее пригодны для изучения хронических заболеваний, которые являются результатом долгосрочного воздействия повреждающих белки или белковые продукты. С учетом этих ограничений, HGD является исключительно мощным инструментом для изучения роциала роль гена и эффект от него мутантов в естественных условиях, а также терапевтических эффектов и регулирования белков и для установления животных моделях болезни (для обзора см. 15). Например, HGD могут быть использованы, чтобы назначить функцию для доменов и аминокислот белков по отдельности введения различных генных конструкций в мышей, которые имеют соответствующие гены нокаут. Кроме того, этот метод может быть использован в любой штамм мыши.
Этот протокол описывает HGD у мышей с акцентом на технических аспектах, необходимых для достижения успешного трансфекции: правильно введения иглы в вену, объем впрыска и скорости доставки. Применение этого метода продемонстрирована на мышиной модели африканского трипаносомоза, смертельной болезни людей и скота 29, 30. В то время как несколько видов трипаносом вызывают заболевания у скота, большинство из них не может вызвать заболевание у человека в связи с врожденной иммунной комплексы в бLOOD называемые трипаносомная литические факторы (ФЦН) 29, 31, 32. Эти порообразующие, липопротеины высокой плотности (HDL) содержат два уникальных, приматов-специфических белков. HPR, лиганд, который облегчает поглощение ФЦН в трипаносом, и APOL-I, литический компонент 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense способен инфицировать людей в связи с выражением сопротивления связанных сывороточного белка (SRA), который связывается с и нейтрализует человеческий APOL-I 34, 39. Бабуин TLF не нейтрализуется SRA из-за его расходящихся APOL-I белка 40. Как сообщалось ранее, с использованием вектора экспрессии млекопитающих (pRG977), трансгенных выражение павиана компонентов TLF у мышей обеспечивает защиту против человека-инфекционный трипаносом 40. Представительные данные, представленные здесь продемонстрировать, как доставка гидродинамическая ген может быть применен для изучения терапевтические эффекты белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
При правильном выполнении HGD является чрезвычайно безопасным и эффективным средством доставки трансгенов. Критические шагов к успешному HGD являются: 1) поставлять нужное количество ДНК в большом объеме физиологического транспортного средства 2) в хвостовую вену мыши 3) менее чем 8 сек. </…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ся Лю (Regeneron Pharmaceuticals) для изначально учит нас технику HGD и д-р Рассел Томсон (Альберт Эйнштейн медицинский колледж) для его постоянного руководства по различным аспектам технологии. Эта работа финансировалась по Хантер-колледже, CUNY запуска средства и NSF Хлеб награда IOS-1249166. Мы благодарим NYULMC Гистопатология Ядро NYUCI Центр поддержки Грант, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 для гистологии на печени мышей.
Materials
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
Riferimenti
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA — comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al. RNA interference in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002).
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery. Adv Genet. 54, 65-82 (2005).
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery of DNA. Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
