마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현
Summary
유체 유전자 전달에 의한 벌거 벗은 DNA의 생체 내 형질에서 최소한의 염증 반응과 동물의 조직에 유전자를 소개합니다. 유전자 산물의 충분한 양의 유전자 기능 및 조절뿐만 아니라, 단백질의 구조 및 기능 분석 될 수 있도록 생성된다.
Abstract
생체 내에서 형질 전환 유전자를 효율적으로 발현은 유전자 기능을 연구하고 질병에 대한 치료법 개발에 매우 중요합니다. 지난 몇 년 동안, 유체 유전자 전달 (HGD)이 설치류에 형질 전환 유전자를 전달하기위한, 간단하고, 빠르고, 안전하고 효과적인 방법으로 떠오르고있다. 이 기술은 관류 기관의 세포막의 투과성을 증가시키는 생리 용액의 대량의 급속한 주입에 의해 생성되는 힘에 의존하고, 따라서 세포로 DNA를 전달한다. HGD의 주요 장점 중 하나는 알몸 플라스미드 DNA (pDNA를)를 사용하여 포유류 세포로 형질 전환 유전자를 도입 할 수있는 기능입니다. 플라스미드를 사용하여 외래 유전자를 도입하는 방법은 매우 안전하고, 최소한의 고효율, 힘들고, 바이러스 사업자에 반대합니다. HGD가 처음 생쥐에 유전자를 전달하기 위해 사용 된, 그것은 이제 올리고 뉴클레오티드, 인공 염색체, RNA, 단백질 및 마우스에 작은 분자를 포함한 물질의 넓은 범위, 래트를 전달하는 데 사용와, 제한된 정도, 다른 동물. 이 프로토콜은 생쥐의 HGD에 대해 설명하고 프로 시저를 성공적으로 수행하는 중요한 방법의 세 가지 주요 측면에 초점을 맞추고 : 정맥에 바늘의 정확한 삽입, 분사의 볼륨 및 배달의 속도. 예를 분비, 영장류 특정 단백질을 인코딩하는 두 유전자의 일시적 발현이 방법의 응용 프로그램을 보여 주어, 아포 지단백 LI (APOL-I)과 합 토글 로빈 관련 단백질 (HPR).
Introduction
에 의해 처음으로 설명하기 때문에 류 등. 및 장 등., 유체 유전자 전달 (HGD)는 설치류 모델 시스템 1, 2 유전자의 기능을 연구하는데 매우 중요한 도구가되고있다. 기술은 표적 기관 1, 2의 세포에 의해 플라스미드 DNA의 흡수를 촉진하기 위하여 마우스의 꼬리 정맥에 용액의 대량 (8~12% 체중)의 급속 주입 (5-7 초)을 포함한다. 이러한 조건은 신장, 비장, 폐와 심장에 간 적은 유전자 발현의 강력한 유전자 발현을 초래할.
10 μg을 pCMV-LacZ를 플라스미드 주입 HGD 날짜 1에 가장 효율적인 비 바이러스 성, 생체 내 유전자 전달 방법을 만드는 간세포의 많은 40 %가 감염 될 수 있습니다. 바이러스 성 항공사와는 달리, pDNA를 준비하기 쉽고, 설치류 호스트 3 면역 반응을 유도하지 않고 끝이 재결합하여 건강 위험하지 않습니다ogenous 바이러스. HGD에 의해 전달 된 DNA 분자가 포장을 필요로하지 않기 때문에 또한,이 방법은 150킬로바이트 4만큼 많은 세균 인공 염색체 (BAC)의 전달에 적합하다. 유체 역학적 방법에 의해 전달 된 분자의 다른 종류의 RNA 5-10, morpholinos와 11, 단백질 12, 13 및 다른 작은 분자 (12, 14)이 (가) 있습니다. 다른 전달 방법에 HGD의 장점과 단점은 문학 15 ~ 20 우수 리뷰에서 논의되었고, 저자의 수는 21-23 절차에 대한 자세한 설명을 제공하고 있습니다.
HGD에 의해 마우스에 형질 전환 유전자를 도입하면 안전하고 1-3, 24 효과적이 방법은 비교 성공 (25)와 쥐에 사용되어왔다. 특정의 수정, 개념 증명 실험은 닭 26, RAB에서 실시 된큰 동물이 기술의 생체 내 응용 프로그램이 과제로 남아,하지만, (27)와 돼지 28 비트. 이 방법을 사용할 때, 또 다른 일반적인 제한은 가능한 포유류 발현 벡터의 많은 유전자 발현의 지속성, 높은 수준을 달성하기 성분이 부족하다는 것이다. 대상 기관에서을 pCMV 룩 플라스미드 유전자 발현을 사용하지만, 초기의 높은 발현 수준이 주입 한 후 첫 주에 급격히 인하, HGD 후 십분 빠르면 분명하다. 장기간의 형질 전환 유전자의 발현은 플라스미드 디자인 3, 24 그러나, 높은 수준의 유전자 발현의 유지가 종종 필요 반복 주사에 사용되는 프로모터와 인트론에 따라 가능하다. 이러한 이유로, HGD가 손상 단백질이나 단백질 제품에 장기간 노출의 결과 만성 질환을 연구 덜 적합 할 수 있습니다. 이러한 한계로, HGD는 PO 공부를위한 매우 강력한 도구입니다유전자 및 그것의 효과 tential 역할 (검토를 위해, 15 참조) 생체 내뿐만 아니라 치료 효과와 단백질의 조절에 질병의 동물 모델을 확립하는 돌연변이. 예를 들어, HGD 개별적으로 각각의 유전자가 녹아웃 한 마우스에 다양한 유전자 구성체를 도입하여 도메인 및 단백질의 아미노산에 기능을 할당하는 데 사용될 수있다. 또한,이 기법은 임의의 마우스 균주에서 사용될 수있다.
배달의 정맥 주입 볼륨과 속도에 정확한 바늘 삽입 :이 프로토콜은 성공적으로 형질 전환을 달성하기 위해 필요한 기술적 인 측면에 초점을 생쥐에 HGD에 대해 설명합니다. 이 방법의 적용은 아프리카 트리파노소마, 인간의 치명적인 질병과 가축 (29, 30)의 마우스 모델에서 입증된다. trypanosomes의 몇몇 종 가축에 질병을 일으키는 원인이 있지만, 대부분은 B의 면역 복합체를 타고난에 의한 인간의 질병을 일으킬 수CTRL 키를 누른라고 trypanosome 세포 용해 인자 (TLFs) 29, 31, 32. 이러한 기공 형성, 고밀도 지단백질 (HDL)의 두 가지 고유, 영장류 특정 단백질이 들어 있습니다. trypanosomes에 TLFs의 흡수를 용이하게 HPR, 리간드, 및 APOL-I, 용해성 구성 요소 31, 33 ~ 38을 Trypanosoma을 brucei의 rhodesiense 인해 바인딩과 인간 APOL-I (34), (39)을 중화 혈청 내성 관련 단백질 (SRA)의 표현으로 인간을 감염시킬 수 있습니다. 비비 TLF는 인해 발산 APOL-I 단백질 40 SRA에 의해 중화되지 않습니다. 포유 동물 발현 벡터 (pRG977), 쥐 원숭이 TLF 구성 요소의 형질 전환 식을 사용하여, 이전에보고 된 인간 감염 trypanosomes (40)에 대한 보호 기능을 부여한다. 여기에 제시된 대표적인 데이터는 유체 역학적 유전자 전달이 단백질의 치료 효과를 연구에 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
올바르게 수행 할 경우, HGD는 유전자 전달의 매우 안전하고 효과적인 방법입니다. 성공적인 HGD에 중요한 단계는 1)보다 8 초에 마우스 3)의 꼬리 정맥에) 생리 식염수 차량 2의 큰 볼륨에서 DNA의 정확한 양을 제공.
주입 과정 자체가 대단한 약간의 손재주가 필요하지만,이 여섯 번째 절차의 성공은 종종 실험주의 준비에있다. 최대한의 유전자 발현을 달성하기 위해 필요한의 pDN…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 처음에 우리에게 기술의 다양한 측면에서 자신의 지속적인 안내 HGD 기술과 러셀 박사 톰슨 (의학의 알버트 아인슈타인 대학)을 가르치는 시아 리우 (Regeneron 제약) 감사합니다. 이 작품은 헌터 칼리지에 의해 투자되었다, CUNY는 기금을 시작하고 NSF 빵 상 IOS-1249166. 우리는 마우스의 간에서 조직학에 대한 NYULMC 조직 병리학 코어 NYUCI 센터 지원 그랜트, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 감사합니다.
Materials
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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