ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג'ין משלוח בעכברים

Summary

בtransfection vivo של DNA עירום על ידי מסירת גן הידרודינמית מציג גנים לתוך הרקמה של בעלי חיים עם תגובה דלקתית מינימאלית. כמויות מספיקות של מוצר גן נוצרות באופן שתפקוד הגן והרגולציה, כמו גם מבנה חלבון ותפקוד ניתן לנתח.

Abstract

ביטוי יעיל של transgenes in vivo הוא בעלת חשיבות מכרעת בלימוד תפקוד גן ובפיתוח טיפולים למחלות. בשנים האחרונות, משלוח הידרודינמית גן (HGD) התפתחה כשיטת פשוטה, מהירה, בטוחה ויעילה לאספקת transgenes למכרסמים. טכניקה זו נשענת על הכוח שנוצר על ידי ההזרקה המהירה של כמויות גדולות של פתרון פיסיולוגי כדי להגדיל את החדירות של קרום תא של איברי perfused ובכך להעביר דנ"א לתוך תאים. אחד היתרונות העיקריים של HGD הוא היכולת להציג transgenes לתאי יונקים באמצעות DNA עירום פלסמיד (pDNA). היכרות עם גן אקסוגני באמצעות פלסמיד היא מינימאלי מייגע, יעיל ביותר ובניגוד לנישאים נגיפיים, בטוח להפליא. HGD שימש בתחילה להעברת גנים לעכברים, הוא משמש כעת כדי לספק מגוון רחב של חומרים, כולל oligonucleotides, כרומוזומים מלאכותיים, רנ"א, חלבונים ומולקולות קטנות לעכברים, חולדותו, במידה מוגבלת, בעלי חיים אחרים. פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים ומתמקד בשלושה היבטים מרכזיים של השיטה שהן קריטיים לביצוע ההליך בהצלחה: הכנסה נכונה של המחט לווריד, נפח ההזרקה ומהירות המשלוח. ניתנות דוגמאות כדי להראות את יישומה של שיטה זו לביטוי החולף של שני גנים המקודדים חלבונים מופרשים, הפרימטים ספציפיים, אפוליפופרוטאין LI (תתנצ-I) וחלבונים הקשורים לhaptoglobin (HPR).

Introduction

מאז התיאור הראשון שלה על ידי יו et al. וג'אנג et al., משלוח הידרודינמית גן (HGD) הפך לכלי רב ערך ללימוד תפקוד גן במערכות מכרסמים מודל ^{1, 2.} הטכניקה כרוכה בהזרקה המהירה (5-7 שניות) בהיקפים גדולים (8-12% ממשקל גוף) של פתרון לוריד הזנב של עכברים כדי להקל על הספיגה של ה-DNA פלסמיד על ידי התאים של אברי מטרת ^{1, 2.} תנאים אלו מובילים לביטוי גנים חזק בכבד ובביטוי פחות גנים בכליות, טחול, הריאות ולב.

הזרקה של 10 מיקרוגרם פלסמיד pCMV-LacZ יכולה transfect ככל 40% מhepatocytes, מה שהופך HGD השיטה היעילה ביותר, לא ויראלי, in vivo מסירת הגן עד כה ^1. בניגוד לנישאים נגיפיים, pDNA הוא קל להכנה, לא לעורר תגובה חיסונית במארח המכרסם ³ ואינו מהווה סיכון בריאותי על ידי recombining עם הסוףוירוסי ogenous. בנוסף, מאחר שמולקולות ה-DNA מועברות על ידי HGD לא צריכה אריזה, שיטה זו מתאימה למשלוח של כרומוזומים בקטריאלי מלאכותיים (BAC) גדולים כמו 150 KB ^4. סוגים אחרים של מולקולות שכבר נמסרו על ידי שיטה הידרודינמית כוללים RNA ^{5-10, 11} morpholinos, חלבוני ^{12, 13} ומולקולות קטנות אחרות ^{12, 14.} היתרונות והחסרונות של HGD על פני שיטות משלוח אחרות כבר נדונו בביקורות מצוינות בספרות ^15-20 ומספר המחברים סיפק תיאור מפורט של ההליך ^21-23.

היכרות transgenes לעכברים על ידי HGD היא בטוחה ויעיל ^{1-3, 24} והשיטה נעשתה שימוש בחולדות עם הצלחה דומה ^25. עם שינויים מסוימים, ניסויי הוכחה של הקונספט בוצעו בתרנגולות ^26, ראבביטים ²⁷ וחזירים ^28, אם כי, vivo היישום בטכניקה זו בבעלי חיים גדולים יותר עדיין מהווה אתגר. בעת השימוש בשיטה זו, עוד הגבלה נפוצה היא שרבים מוקטורי הביטוי היונקים הזמינים חסרים את המרכיבים כדי להשיג רמה גבוהה מתמשכת, של ביטוי גנים. באמצעות פלסמיד, ביטוי גני pCMV לוק באברי המטרה ניכר כבר בעשר דקות לאחר HGD, לעומת זאת, רמת הביטוי הראשונית, הגבוהה יורדת בצורה חדה בשבוע שלאחר הזרקת ¹ הראשון. ביטוי transgene ארוך טווח אפשרי בהתאם לאמרגן ואינטרון השתמש בפלסמיד עיצוב ^{3, 24} זריקות עם זאת, תחזוקה של ביטוי גנים ברמה הגבוהה דורשת לעתים קרובות חוזרות ונשנות. מסיבה זו, HGD עשוי להיות פחות מתאים ללמוד מחלות כרוניות שהן תוצאה של חשיפה ארוך טווח לחלבונים מזיקים או מוצרי חלבון. עם המגבלות האלה, HGD הוא כלי רב עוצמה במיוחד ללימוד פותפקיד tential של גן ואת ההשפעה שלו מוטציות in vivo, כמו גם את ההשפעות והרגולציה של חלבונים הטיפוליים ולהקמת מודלים של בעלי חיים למחלות (לסקירה, ראה ^15). לדוגמא, HGD ניתן להשתמש כדי להקצות פונקציה לתחומים וחומצות אמינו של חלבונים על ידי החדרת בנפרד מבני גנים שונים לעכברים שהגנים המתאימים בנוקאאוט. יתר על כן, בטכניקה זו ניתן להשתמש בכל זן עכבר.

פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים עם דגש על ההיבטים הטכניים הדרושים כדי להשיג transfection המוצלח: החדרת מחט נכונה לוריד, הזרקת הנפח ומהירות המשלוח. יישומה של שיטה זו בא לידי הביטוי במודל של עכברים של trypanosomiasis אפריקה, מחלה של בני אדם ובעלי חיים קטלנית ^{29, 30.} בעוד כמה מינים של trypanosomes לגרום למחלות בבעלי חיים, רוב לא יכול לגרום למחלה בבני אדם בשל מולדת מתחמים חיסוניים בבגורמי עונג עילאי טבע דם הנקראים trypanosome ממס (TLFs) ^{29, 31 ב, 32.} , ליפופרוטאינים אלה יוצרים הנקבוביות בצפיפות גבוהה (HDL) מכילים שני חלבונים ייחודיים, הפרימטים ספציפיים:. HPR, ליגנד, המאפשר את הספיגה של TLFs לtrypanosomes, ותתנצ-I, את רכיב ממס ^{ביום 31 ב, 33-38} Trypanosoma rhodesiense brucei הוא מסוגל להדביק בני אדם בשל ביטוי של חלבון בסרום הקשורים התנגדות (SRA) שנקשר ומנטרל תתנצ-אני אדם ^{34, 39.} בון TLF לא נוטרל על ידי SRA בשל תתנצ-חלבון מסתעף ^40. כפי שדווח בעבר, באמצעות וקטור יונקים ביטוי (pRG977), ביטוי מהונדס של רכיבי TLF בון בעכברים מקנה הגנה מפני trypanosomes אדם זיהומיות ^40. הנתונים שהוצגו כאן הנציג להדגים כיצד מסירת גן הידרודינמית ניתן להחיל כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של חלבון.

Protocol

כל הניסויים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בהאנטר קולג', האוניברסיטה של ​​העיר ניו יורק. 1. הכנה של ה-DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי פיק מושבה אחת של חיי…

Representative Results

מיקום נכון של המחט לוריד הזנב של העכבר (כפי שמודגם באיור 1) הוא תנאי הכרחי לאספקת transgene בהצלחה על ידי transfection מבוסס הידרודינמיקה. לעתים קרובות החלק המאתגר ביותר של הטכניקה, לעומת זאת, הוא השמירה של המחט בתוך וריד הזנב ללא תנועה כך שכל הנפח של הזריקה יכול להיות מ?…

Discussion

כאשר מבוצע כהלכה, HGD הוא אמצעי בטוח ויעיל להפליא של משלוח transgene. השלבים הקריטיים לHGD המוצלח הם: 1) מספק את הכמות הנכונה של ה-DNA בנפח גדול של מי מלח רכב 2) לוריד הזנב של עכבר 3) בפחות מ -8 שניות.

למרות התהליך של הזרקה עצמה ללא ספק דורש קצת מי…

Materials

Alcohol Prep Wipe	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetric	AAT Bioquest	13801
Conical Tube, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Mouse Tail Illuminator	Braintree Scientific	MTI RST	Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (mammalian expression vector)	Regeneron Pharmaceuticals		Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira	Fisher	NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip	BD	309657	Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD