الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث
Summary
النفث ميكروفلويديك ضد واجهة قطرات الدهون طبقة ثنائية يوفر وسيلة موثوقة لتوليد الحويصلات مع السيطرة على التماثل الغشاء، إدراج البروتينات عبر الغشاء، والتغليف من المواد. هذه التقنية يمكن تطبيقها على دراسة مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية حيث يتم المطلوب الجزيئات الحيوية مجزأة.
Abstract
يعرض أسفل إلى أعلى البيولوجيا التركيبية نهجا جديدا للتحقيق وإعادة تشكيل النظم البيوكيميائية، وربما الحد الأدنى من الكائنات الحية. هذا المجال الناشئ يشارك المهندسين والكيميائيين وعلماء الأحياء، والفيزياء لتصميم وتجميع المكونات البيولوجية الأساسية في المجمع، وأنظمة تعمل من أسفل إلى أعلى. هذه النظم من أسفل إلى أعلى قد يؤدي إلى تطوير خلايا اصطناعية للاستفسارات البيولوجية الأساسية والعلاجات المبتكرة 1،2. يمكن الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) بمثابة منصة نموذجية لعلم الأحياء الاصطناعية نظرا لهيكل غشاء الخلية مثل والحجم. النفث ميكروفلويديك، أو microjetting، هو الاسلوب الذي يسمح لتوليد GUVs مع حجم تسيطر عليها، وتكوين الغشاء والبروتين عبر الغشاء التأسيس، والتغليف 3. المبدأ الأساسي لهذه الطريقة هو استخدام متعددة، البقول السوائل عالية التردد التي تم إنشاؤها بواسطة جهاز النافثة للحبر بيزو دفعتها إلى تشوه وعلقت لطبقة ثنائية IPID إلى GUV. هذه العملية هي أقرب إلى فقاعات الصابون تهب من فيلم الصابون. من خلال تغيير تركيبة الحل متدفق، وتكوين الحل يشمل، و / أو المكونات المدرجة في طبقة ثنائية، يمكن للباحثين تطبيق هذه التقنية لخلق الحويصلات حسب الطلب. وتصف هذه الورقة الإجراء لتوليد الحويصلات بسيطة من طبقة ثنائية واجهة الحبرية بواسطة microjetting.
Introduction
أصبح من الواضح بشكل متزايد أن بيولوجيا الخلية هي مشكلة متعددة المستويات التي تنطوي على دمج فهمنا من الجزيئات إلى الخلايا. بالتالي، مع العلم بالضبط كيفية عمل الجزيئات بشكل فردي ليست كافية لفهم السلوكيات الخلوية المعقدة. هذا يرجع جزئيا إلى وجود سلوكيات الناشئة من أنظمة متعددة المكونات، كما يتضح من إعادة تشكيل الأكتين التفاعل مع شبكة حويصلات الدهنية طبقة ثنائية 4، والتجمع المغزل الإنقسامية في القيطم استخراج 5، وديناميات المكانية الأجهزة انقسام الخلايا البكتيرية 6. طريقة واحدة لاستكمال نهج الاختزالية للتشريح العمليات الجزيئية من المنظومات الحية هو اتخاذ النهج المعاكس من إعادة تشكيل السلوكيات الخلوية باستخدام مجموعة صغيرة من المكونات البيولوجية. جزء هام من هذا النهج ينطوي على التغليف موثوقة من الجزيئات الحيوية في حجم المحصورة، سمة أساسية من سمات خلية.
e_content "> العديد من الاستراتيجيات المتبعة لتغليف الجزيئات الحيوية لدراسة نظم بيوميمتيك. النظام الأكثر ملاءمة من الناحية البيولوجية هو الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية، والتي تحاكي القيود البيوكيميائية والفيزيائية التي تفرضها غشاء البلازما الخلية تشكيل حويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) من خلال electroformation 7، واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لتوليد GUV 14، وعادة ما يكون الفقراء العائد التغليف نظرا لتعارضه مع العازلة الملح عالية 8. أيضا يتطلب Electroformation أحجام عينة كبيرة (> 100 ميكرولتر)، والتي يمكن أن يكون مشكلة للعمل مع البروتينات المنقى ، ويشتمل على نحو غير فعال جزيئات كبيرة بسبب صعوبة نشرها بين طبقات الدهون متباعدة عن كثب. وقد وضعت عدة نهج ميكروفلويديك لتوليد حويصلات الدهنية. طرق مستحلب مزدوجة، التي تمر من خلال مكونات واجهات اثنين بين طبقات المياه نفط المياه (W / O / W)، تعتمد على التبخر من فوالمذيبات latile لدفع تشكيل طبقة ثنائية الدهن 9. وقد استخدم البعض الآخر خط التجميع ميكروفلويديك التي تنتج تيار مستمر من الدهون طبقة ثنائية حويصلات أو 10 في خطوتين مستقلة 11. قمنا بتطوير تقنية بديلة تقوم على تطبيق بسرعة نبضات السائل ضد واجهة قطرات طبقة ثنائية لإنتاج 12 GUVs من حجم تسيطر عليها، وتكوينها، والتغليف. نهجنا، والمعروفة باسم النفث ميكروفلويديك، ويقدم المزايا مجتمعة من عدة تقنيات الجيل حويصلة القائمة، وتوفير نهج لإنشاء أنظمة الجزيئية البيولوجية وظيفية للتحقيق في مجموعة متنوعة من المشاكل البيولوجية.Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تطوير العديد من التقنيات لتوليد حويصلة، بما في ذلك electroformation، مستحلب، والجيل الحبرية 14-16. ومع ذلك، وتقنيات تجريبية جديدة ضرورية للسماح لتصميم النظم البيولوجية مع التشابه المتزايد لنظم المعيشة. وعرضت وسائل ميكروفلويديك على وجه الخصوص زيادة مستوى السيطرة…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مايك Vahey من مختبر فليتشر في جامعة كاليفورنيا، بيركلي لتقديم المشورة بشأن المعلمات microjetting. وقد رعت هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL117748 DP2-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
Riferimenti
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
