Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting
Summary
De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.
Abstract
De abajo hacia arriba la biología sintética presenta un nuevo enfoque para la investigación y la reconstitución de los sistemas bioquímicos y, potencialmente, organismos mínimos. Este campo emergente involucra ingenieros, químicos, biólogos y físicos para diseñar y ensamblar componentes biológicos básicos en los sistemas complejos, que funcionan desde abajo hacia arriba. Tales sistemas ascendentes podrían conducir al desarrollo de las células artificiales para investigaciones biológicas fundamentales y terapias innovadoras 1,2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) pueden servir como una plataforma modelo para la biología sintética debido a su estructura de la membrana alveolar y tamaño. De chorro de microfluidos, o microjetting, es una técnica que permite la generación de GUVs con un tamaño controlado, composición de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación 3. El principio básico de este método es el uso de múltiples pulsos de fluido, de alta frecuencia generadas por un dispositivo de inyección de tinta piezoeléctrico accionado para deformar una L suspendidabicapa IPID en un jefe. El proceso es similar a soplar burbujas de jabón a partir de una película de jabón. Mediante la variación de la composición de la solución de hidromasaje, la composición de la solución que abarca, y / o los componentes que se incluyen en la bicapa, los investigadores pueden aplicar esta técnica para crear vesículas personalizadas. En este trabajo se describe el procedimiento para generar vesículas simples de una bicapa de interfaz de gota por microjetting.
Introduction
Se ha convertido cada vez más claro que la biología celular es un problema multi-escala que implica integrar nuestra comprensión de las moléculas a las células. En consecuencia, saber con precisión cómo las moléculas trabajan en forma individual no es suficiente para comprender los comportamientos celulares complejos. Esto se debe en parte a la existencia de comportamientos emergentes de sistemas de varios componentes, como se ejemplifica en la reconstitución de la interacción actina red con vesículas de bicapa lipídica 4, el montaje de huso mitótico en Xenopus extracto 5, y la dinámica espacial de los mecanismos de división celular bacteriana 6. Una forma de complementar el enfoque de la reduccionista de la disección de los procesos moleculares de los sistemas vivos es tomar el camino contrario de la reconstitución de comportamientos celulares utilizando un conjunto mínimo de componentes biológicos. Una parte crítica de este enfoque implica la encapsulación fiable de biomoléculas en un volumen confinado, una característica clave de una célula.
e_content "> Existen varias estrategias para encapsular biomoléculas para el estudio de sistemas biomiméticos. El sistema más biológicamente relevante es membranas bicapa de lípidos, que imitan las limitaciones físicas y bioquímicas impuestas por la membrana plasmática de la célula. formación de vesículas unilamelares gigantes (Guvs) por electroformation 7, una de las técnicas más ampliamente utilizadas para la generación de GUV 14, tiene típicamente un pobre rendimiento de encapsulación debido a su incompatibilidad con tampón de alta concentración de sal 8. Electroformation también requiere grandes volúmenes de muestra (> 100 l), lo que podría ser un problema para trabajar con proteínas purificadas , e incorpora de manera ineficiente moléculas grandes debido a la dificultad de difusión entre las capas de lípidos estrechamente espaciados. Se han desarrollado varios enfoques de microfluidos para la generación de vesículas de lípidos. Los métodos de emulsión doble, que pasan a través de dos componentes de las interfaces entre las capas de aceite-agua-agua (W / O / W), se basa en la evaporación de un VOlatile disolvente para impulsar la formación de bicapa lipídica 9. Otros han utilizado una línea de montaje de microfluidos que produce una corriente continua de vesículas bicapa de lípidos 10 o en dos etapas independientes 11. Hemos desarrollado una técnica alternativa basada en la aplicación rápidamente pulsos de fluido contra una bicapa interfaz de gotita 12 para producir GUVs de tamaño controlado, composición, y la encapsulación. Nuestro enfoque, conocido como chorro de microfluidos, ofrece las ventajas combinadas de varias técnicas de generación de vesículas existentes, proporcionando un enfoque para la creación de sistemas biomoleculares funcionales para la investigación de una variedad de problemas biológicos.Protocol
Representative Results
Discussion
Muchas técnicas se han desarrollado para la generación de vesículas, incluyendo electroformation, emulsión, y la generación de gotitas 14-16. Sin embargo, las nuevas técnicas experimentales son necesarios para permitir el diseño de sistemas biológicos con la creciente similitud con los sistemas vivos. Métodos de microfluidos, en particular, han ofrecido un mayor nivel de control que rige unilamellarity membrana, monodispersidad de tamaño, y los contenidos internos 17,18, con lo que los mo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mike Vahey del Laboratorio Fletcher de la Universidad de California, Berkeley para el asesoramiento sobre los parámetros microjetting. Este trabajo fue patrocinado por el NIH subvención HL117748 DP2-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
Riferimenti
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