Bicouche lipidique des vésicules génération utilisant microfluidique jets
Summary
Jet microfluidique contre une bicouche lipidique de l'interface des gouttelettes fournit un moyen fiable pour générer des vésicules avec le contrôle de l'asymétrie de la membrane, l'incorporation de protéines transmembranaires, et l'encapsulation des matériaux. Cette technique peut être appliquée pour étudier une variété de systèmes biologiques où les biomolécules compartimentés sont souhaitées.
Abstract
Bottom-up biologie synthétique présente une nouvelle approche pour l'étude et la reconstitution des systèmes biochimiques et, potentiellement, les organismes minimes. Ce domaine émergent engage des ingénieurs, des chimistes, des biologistes et physiciens de concevoir et assembler des composants biologiques de base dans les systèmes complexes, fonctionnant de bas en haut. Ces systèmes bottom-up pourraient conduire à l'élaboration de cellules artificielles pour des enquêtes biologiques fondamentales et des thérapeutiques innovantes 1,2. Vésicules unilamellaires géants (GUVS) peuvent servir de plate-forme de modèle pour la biologie synthétique en raison de leur structure et la taille membrane cellulaire comme. Éjection microfluidique, ou microjetting, est une technique qui permet la génération de GUVs de taille contrôlée, la composition de la membrane, une protéine transmembranaire de constitution, et l'encapsulation 3. Le principe de base de cette méthode est l'utilisation de plusieurs, des impulsions de fluide à haute fréquence générés par un dispositif à jet d'encre piézo-actionné pour déformer une suspendu lbicouche ipid dans une GUV. Le processus est semblable à des bulles de savon à partir d'un film de savon. En faisant varier la composition de la solution à jets, la composition de la solution globale, et / ou les composants inclus dans la bicouche, les chercheurs peuvent appliquer cette technique pour créer des vésicules personnalisés. Cet article décrit la procédure pour générer des vésicules simples à partir d'un bicouche d'interface de gouttelettes par microjetting.
Introduction
Il est devenu de plus en plus clair que la biologie cellulaire est un problème multi-échelle qui consiste à intégrer notre compréhension des molécules aux cellules. Par conséquent, savoir précisément comment les molécules travaillent individuellement n'est pas suffisante pour comprendre les comportements cellulaires complexes. Ceci est partiellement dû à l'existence de comportements émergents de systèmes multi-composants, comme en témoigne la reconstitution de l'actine interaction avec le réseau avec des vésicules bicouches lipidiques 4, l'assemblage du fuseau mitotique dans Xenopus extrait 5, et la dynamique spatiale de bactéries mécanismes de la division cellulaire 6. Une façon de compléter l'approche réductionniste de disséquer les mécanismes moléculaires des systèmes vivants est de prendre la démarche inverse de reconstituer les comportements cellulaires en utilisant un ensemble minimal de composants biologiques. Une partie essentielle de cette approche implique l'encapsulation fiable de biomolécules dans un volume confiné, un élément clé de la cellule.
e_content "> Il existe plusieurs stratégies pour encapsuler des biomolécules pour l'étude de systèmes biomimétiques. Le système le plus d'intérêt biologique est membranes bicouches lipidiques, qui imitent les contraintes biochimiques et physiques imposées par la membrane plasmique de la cellule. formation de vésicules unilamellaires géantes (les GUVS) par électroformation 7, l'une des techniques les plus largement utilisés pour la production d'GUV 14, a généralement un rendement d'encapsulation pauvres en raison de son incompatibilité avec le tampon de sel trop élevée 8. électroformation exige aussi grands volumes d'échantillons (> 100 pi), ce qui pourrait être un problème pour travailler avec des protéines purifiées , et incorpore de manière inefficace grandes molécules en raison de la difficulté de diffusion entre les couches lipidiques peu espacées. Plusieurs approches microfluidiques pour générer des vésicules lipidiques ont été développés. Les procédés de double émulsion, qui passent des composants par l'intermédiaire de deux interfaces entre les couches d'eau-huile-eau (W / O / W), repose sur l'évaporation d'un volatile solvant pour conduire lipides formation bicouche 9. D'autres ont utilisé une ligne d'assemblage microfluidique qui produit un courant continu de vésicules bicouches lipidiques 10 ou en deux étapes indépendantes 11. Nous avons mis au point une autre technique basée sur l'application d'impulsions de fluide rapide contre une bicouche d'interface des gouttelettes 12 pour produire GUVs de taille contrôlée, la composition, et l'encapsulation. Notre approche, connue sous le nom de jet microfluidique, offre les avantages combinés de plusieurs techniques existantes de production de vésicules, fournissant une approche pour créer des systèmes biomoléculaires fonctionnels pour enquêter sur une série de problèmes biologiques.Protocol
Representative Results
Discussion
De nombreuses techniques ont été mises au point pour la production de vésicules, comprenant électroformation, d'émulsion, et la génération de gouttelettes de 14 à 16. Cependant, de nouvelles techniques expérimentales sont nécessaires pour permettre la conception de systèmes biologiques avec une similitude de plus en plus de systèmes vivants. Méthodes microfluidiques, en particulier, ont offert un niveau accru de contrôle régissant unilamellarity de membrane, monodispersité de la taille, et…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mike Vahey de la Fletcher Lab de l'Université de Californie, Berkeley pour obtenir des conseils sur les paramètres de microjetting. Ce travail a été soutenu par NIH DP2 HL117748-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
Riferimenti
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