Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi
Summary
Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.
Abstract
Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji potansiyel biyokimyasal sistemleri ve, minimal organizmalar soruşturma ve yeniden yapılandırmak için yeni bir yaklaşım sunuyor. Bu gelişmekte olan bir alan aşağıdan yukarıya karmaşık, işleyen sistemlere temel biyolojik bileşenlerini tasarlamak ve oluşturmak için mühendisleri, kimyagerler, biyologlar, ve fizikçileri yürütmektedir. Bu gibi alt-up sistemleri temel biyolojik öğrenmek ve yeni tedavilerin 1,2 yapay hücre gelişimine neden olabilir. Dev tek tabakalı veziküller (GUVs) nedeniyle hücre benzeri zar yapısı ve boyutu sentetik biyoloji için bir model platform olarak hizmet edebilir. Mikroakışkan jeti veya microjetting, kontrollü boyutu, zar kompozisyonu, transmembran protein dahil edilmesi, ve kapsülleme 3 GUVs üretimi sağlayan bir tekniktir. Bu yöntemin temel ilkesi, bir süspansiyon haline l deforme edilmesi için bir piezo-mürekkep püskürtme çalıştırılan cihazı tarafından oluşturulan birden çok, yüksek frekanslı darbe sıvı kullanılmasıdırBir GUV içine IPID iki tabakalı. Süreç bir sabun filmden sabun baloncukları üfleme benzer. Jeti çözeltisi kapsayan çözeltisinin kompozisyon ve / veya bileşenlerin bileşimi değiştirilerek ikili katmanın dahil, araştırmacılar özelleştirilmiş vezikülleri oluşturmak için bu tekniği uygulayabilir. Bu kağıt microjetting bir damlacık arayüzü bilayeri basit veziküller oluşturmak için prosedürü açıklar.
Introduction
Bu hücre biyolojisi moleküllerin hücrelere anlayışımızı entegre içeren çok-ölçekli bir sorun olduğunu giderek daha açık hale gelmiştir. Sonuç olarak, moleküller tek tek çalışmak nasıl tam bilmeden kompleks hücresel davranışları anlamak için yeterli değildir. Bu 5 özü Xenopus lipid iki katmanlı kesecikler 4, mitotik iğ takımı ile aktin ağ etkileşim yeniden oluşturulması ile örneklendiği gibi, kısmen çok bileşenli sistemlerin ortaya çıkan davranış varlığına ve bakteriyel hücre bölünmesi makine 6 mekânsal dinamiği. Canlı sistemlerin moleküler süreçleri diseksiyon indirgemeci yaklaşımını tamamlamak için tek yolu, biyolojik bileşenlerin en az bir dizi kullanarak hücresel davranışları yeniden yapılandırma tersi bir yaklaşım almaktır. Bu yaklaşımın önemli bir parçası, bir kapalı hacim içinde biyomoleküllerin güvenilir kapsülleme, bir hücrenin önemli bir özelliği içerir.
e_content "> birkaç strateji biomimetik sistemlerin çalışılması için biyomoleküllerin kapsülleyici için vardır. biyolojik olarak en uygun sistem, hücrenin plazma zarının tarafından uygulanan biyokimyasal ve fiziksel kısıtlamaları taklit eder. electroformation 7 tarafından dev tek katmanlı veziküller (GUVs) oluşturulması lipid iki katmanlı membranlar, olduğu, saflaştırılmış proteinler ile çalışmak için bir sorun olabilir GUV nesil 14 için en yaygın kullanılan tekniklerden biri, tipik olarak yüksek tuz tamponu 8 ile uyumsuzluk nedeniyle kötü kapsülleme verim vardır. Electroformation de büyük örnek hacimleri gerektirir (> 100 ul), ve verimsiz yakın aralıklı lipid tabakaları arasında difüzyon zorluğu nedeniyle büyük molekülleri kapsar. lipid veziküllerin üretilmesi için çeşitli yaklaşımlar mikroakışkan. W / O (katmanlar, su-yağ-su arasında iki arayüzleri üzerinden geçiş bileşeni çift emülsiyon yöntemleri geliştirilmiştir / W), bir vo buharlaşması dayanırlipid iki katmanlı oluşum 9 sürücüye latile solvent. Diğer lipid iki katmanlı veziküller 10 ya da iki bağımsız adımda 11 içinde sürekli bir akış üreten bir mikroakışkan montaj hattı kullanılmıştır. Biz hızla kontrollü boyutu, kompozisyon ve kapsülleme GUVs üretmek için bir damlacık arayüz çift-katlı 12 karşı sıvı darbeleri uygulamadan dayalı alternatif bir teknik geliştirdiler. Microfluidic jeti olarak bilinen bizim yaklaşım, biyolojik sorunları çeşitli araştırılması için fonksiyonel biyomoleküler sistemleri yaratmak için bir yaklaşım sağlayarak, mevcut birkaç vezikül üretim teknikleri kombine avantajlar sunuyor.Protocol
Representative Results
Discussion
Birçok teknik electroformation, emülsiyon ve damlacık oluşturma 14-16 dahil olmak üzere, kabarcık üretimi için geliştirilmiştir. Ancak, yeni deneysel teknikler canlı sistemler için artan benzerliği olan biyolojik sistemlerin tasarımı için izin vermek için gereklidir. Özellikle mikroakışkan yöntemler yakın biyoloji kesecik modelleri getirerek, membran unilamellarity, büyüklüğü monodispersiteye ve iç içeriği 17,18 yöneten kontrol artan bir düzeyde teklif var. Ayrıca, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz microjetting parametreleri üzerinde tavsiye California, Berkeley Üniversitesi'nde Fletcher Lab Mike Vahey teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe DP2 HL117748-01 tarafından sponsor oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
Riferimenti
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
