Abstract
यह गंभीर संक्रमण के विकास के लिए उनके अधिक से अधिक जोखिम को देखते हुए, जठरांत्र (सैनिक) immunosuppressed रोगियों के पथ में cytomegalovirus (सीएमवी) के संक्रमण की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. सीएमवी संक्रमण का पता लगाने के लिए कई प्रयोगशाला तरीकों सीरम विज्ञान, वायरल संस्कृति, और आणविक विधियों सहित विकसित किया गया है. अक्सर, इन तरीकों के साथ सीएमवी प्रणालीगत भागीदारी को दर्शाते हैं और विशेष रूप से स्थानीय ऊतक भागीदारी की पहचान नहीं है. इसलिए, सैनिक पथ में सीएमवी संक्रमण का पता लगाने अक्सर बायोप्सी ऊतक के पारंपरिक ऊतक विज्ञान के द्वारा किया जाता है. Immunohistochemistry (आईएचसी) के साथ संयोजन के रूप में hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला इन बायोप्सी की जांच का मुख्य आधार बनी है. एच ई और आईएचसी कभी कभी व्याख्या मुश्किल है, जिससे असामान्य (गोलमोल) धुंधला पैटर्न में परिणाम. यह सीएमवी के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) सफलतापूर्वक बहुत लिए formalin-तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) बायोप्सी ऊतक पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि दिखाया गया थाउच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक नैदानिक प्रयोगशाला स्थापित करने में FFPE बायोप्सी ऊतक में सीएमवी का पता लगाने के लिए qPCR परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए है. इस विधि सैनिक बायोप्सी में सीएमवी के लिए गोलमोल धुंधला के मामलों में रोगियों के लिए काफी लाभ होने की संभावना है.
Introduction
नैदानिक नमूनों में cytomegalovirus (सीएमवी) के संक्रमण की व्याख्या गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है. सीएमवी herpesviruses की betaherpesvirinae उपप्रजाति का एक सदस्य है. अन्य herpesviruses के लिए इसी प्रकार, सीएमवी सक्रिय वायरल प्रतिकृति 1 की कमी की विशेषता लगातार या अव्यक्त संक्रमण स्थापित करने की क्षमता है. वायरस के पुनर्सक्रियन रोग अभिव्यक्तियों 2-4 के साथ हो सकता है, जो virion रिहाई के द्वारा होती सक्रिय वायरल प्रतिकृति के लिए अग्रणी, तनाव या अन्य प्रतिरक्षादमन के समय के दौरान हो सकता है. जठरांत्र (सैनिक) सीएमवी रोग के लक्षण अक्सर पेट दर्द और / या खूनी दस्त शामिल हैं 1.
ऊतक विज्ञान द्वारा सीएमवी आंत्रशोथ का निदान hematoxylin और सीएमवी वायरल समावेशन की पहचान करने के लिए eosin (एच एंड ई) का इस्तेमाल करता है. नैदानिक संदेह उच्च अभी तक कोई स्पष्ट समावेशन मनाया जाता है जहां मामलों में, immunohistochemistry (आईएचसी) अक्सर एक सहायक परीक्षा पद्धति के रूप में प्रयोग किया जाता है. हालांकि, आईएचसीभी व्याख्या मुश्किल (चित्रा 2) 5, जिससे दुर्लभ गैर क्लासिक दिखने सेलुलर धुंधला पैटर्न (गोलमोल) द्वारा बाधा उत्पन्न किया जा सकता है. यह formalin-तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) सैनिक बायोप्सी ऊतक और सैनिक बायोप्सी में सीएमवी पता लगाने के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) से निकाले डीएनए का उपयोग करने की मांग की थी. इस तकनीक सैनिक बायोप्सी में सीएमवी का पता लगाने में बहुमूल्य होना दिखाया, और गोलमोल आईएचसी धुंधला मामलों 5,6 में विशेष रूप से उपयोगी है किया गया है. इसके अलावा, qPCR भी यह 6 उपलब्ध है जब अतिरिक्त नैदानिक सीएमवी परीक्षण डाटा के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी दिखाया गया है. सीएमवी का पता लगाने में qPCR का प्रयोग सीएमवी के लिए नैदानिक संदेह अधिक है जिन मामलों में पहले निदान और उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन एच ई और सीएमवी आईएचसी नकारात्मक हैं.
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Protocol
संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन के साथ, इलेक्ट्रॉनिक प्रयोगशाला डेटाबेस की एक खोज जठरांत्र में cytomegalovirus (सीएमवी) के संक्रमण के मामलों ऊतकविकृतिविज्ञानी से निदान (सैनिक) बायोप्सी (hematoxylin का प्रतिनिधित्व (FFPE) ब्लॉक और एम्बेडेड formalin-तय, आयल की पहचान करने के लिए किया गया था eosin (एच एंड ई) और / या immunohistochemistry (आईएचसी)).
FFPE सैनिक बायोप्सी ऊतक से 1. ऊतक प्रसंस्करण
- Cytomegalovirus (सीएमवी) के लिए FFPE सैनिक बायोप्सी ऊतक ब्लॉक लीजिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR). इन ब्लॉकों कमरे के तापमान पर जमा हो जाती है.
- ब्लॉक की विशिष्ट पहचान संख्या के साथ पूर्व लेबल 1.7 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों.
- सूक्ष्म handwheel लॉक.
- कैसेट दबाना में ऊतक ब्लॉक सीट.
- एक ताजा, अप्रयुक्त ब्लेड का प्रयोग, सूक्ष्म पर चाकू कोण को ब्लॉक संरेखित.
- 10 माइक्रोन मोटी वर्गों में कटौती करने के लिए सूक्ष्म समायोजित करें.
- वें अनलॉकई handwheel और अग्रिम ब्लेड की ओर ब्लॉक.
- प्रत्येक कटौती ऊतक की एक पुस्तक में रोल करने के लिए अनुमति, 10 माइक्रोन मोटी अंतराल पर ब्लॉक के 5 वर्गों में कटौती. प्रत्येक पुस्तक वांछित बायोप्सी ऊतकों की एक पर्याप्त प्रतिनिधित्व होता है कि सुनिश्चित करें.
- सूक्ष्म handwheel लॉक.
- संदंश के साथ, केवल पार संक्रमण के लिए क्षमता को कम करने के क्रम में आयल द्वारा पुस्तक में हेरफेर करने के लिए सावधान किया जा रहा है, पूर्व लेबल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ऊतक के सभी 5 स्क्रॉल जगह है. ट्यूब पर टोपी स्नैप और रैक पर इसे वापस जगह है.
- सूक्ष्म से ऊतक ब्लॉक निकालें.
- निकालें और ब्लेड त्यागें.
- पिछले ऊतक के संपर्क में आया हो सकता है कि किसी भी सतहों या उपकरणों शुद्ध करना.
- चाकू धारक में एक ताजा, अप्रयुक्त ब्लेड रखें.
- दोहराएँ संसाधित करने के लिए प्रत्येक अतिरिक्त ब्लॉक के लिए 1.4-1.14 कदम. ऊतक स्क्रॉल युक्त microfuge ट्यूबों टिम तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता हैडीएनए निष्कर्षण के ए.
FFPE सैनिक बायोप्सी ऊतक की स्क्रॉल से 2. डीएनए निष्कर्षण
नोट: इस प्रोटोकॉल FFPE ऊतक डीएनए निष्कर्षण किट (सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) का उल्लेख कर सावधानी) के पैकेज डालने से अनुकूलित है.
- प्रत्येक नमूना microfuge ट्यूब के लिए: 1 मिलीलीटर xylene (एमएसडीएस का संदर्भ लें सावधानी) जोड़ें. सख्ती 10 सेकंड के लिए ढक्कन और भंवर बंद करें.
- के रूप में विशेष रूप से निम्नलिखित संशोधनों के साथ निर्माता के उत्पाद डालने में उल्लिखित डीएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें.
- सबसे पहले प्रत्येक microfuge ट्यूब के लिए आंतरिक नियंत्रण (आईसी) के 6 μl जोड़ें.
- 1 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर ATL / proteinase कश्मीर सेल ऊष्मायन के बाद, 1 घंटे के लिए, 30 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर बजाय 90 डिग्री सेल्सियस सेते हैं.
- अंतिम डीएनए क्षालन चरण के दौरान, ध्यान से डीएनए शुद्धि स्तंभ का ढक्कन खोलने के लिए और नहीं बल्कि buffe से, झिल्ली के केंद्र में 50 μl आसुत DNase / RNase मुफ्त पानी लागूआर खा लिया.
नोट: उचित भंडारण और अभिकर्मकों की तैयारी के लिए पैकेज डालने का संदर्भ लें. डीएनए सभी 5 FFPE स्क्रॉल से निकाला जाना चाहिए. कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर सभी centrifugation के चरणों को पूरा करें.
सीएमवी के लिए 3. QPCR
- पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रक्रिया
- सीएमवी परख रन के लिए एक एक्सेल पीसीआर वर्कशीट उत्पन्न करें. इस एक्सेल वर्कशीट मिलीग्राम के साथ मास्टर मिश्रण बनाने के लिए आवश्यक प्रत्येक अभिकर्मक की कुल राशि की गणना करता है. यह नमूना प्रति जरूरत प्रत्येक अभिकर्मक की राशि (नीचे सूचीबद्ध) टाइम्स नमूने और नियंत्रण की संख्या अधिक पलता एक (कारण pipetting को नुकसान की भरपाई करने के लिए).
- राशि में प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में निम्नलिखित अभिकर्मकों संकेत शामिल हैं:
अभिकर्मक0; नमूना प्रति राशि
सीएमवी नियंत्रण रेखा मास्टर मिश्रण शीशी 12.5 μl
मिलीग्राम समाधान पीले शीशी 2.5 μl
कुल मात्रा 15.0 μl
- राशि में प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में निम्नलिखित अभिकर्मकों संकेत शामिल हैं:
- एक पानी या कोई लक्ष्य नियंत्रण (एनटीसी), नकारात्मक नियंत्रण, एक कम सकारात्मक नियंत्रण, एक उच्च सकारात्मक नियंत्रण, और QS3 या QS4 या तो, और सभी रोगी के नमूने, हर परख में शामिल करें चलाते हैं. केशिकाओं इस क्रम में स्थापित किया जाना चाहिए.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है कि वास्तविक समय पीसीआर साधन के लिए ठंडा ब्लॉक विशिष्ट प्राप्त ठंडा ब्लॉक में उचित केशिका ट्यूब रखें. केशिका ट्यूब की सतह को छुआ तक नहीं. केशिकाओं से निपटने जब हमेशा दस्ताने का उपयोग करें.
- प्रवर्धन उत्पादन के साथ दूषित नहीं एक स्वच्छ हुड में सभी पोलीमर्स श्रृंखला प्रतिक्रियाओं सेट अपटीएस.
- सभी रोगी के नमूने, प्लस 5 नियंत्रण परीक्षण करने के लिए पीसीआर किट से मास्टर शीशियों की सही संख्या निकालें. चलो मास्टर शीशियों, मिलीग्राम समाधान, और ठंडा ब्लॉक में पीसीआर ग्रेड पानी पिघलना. प्रत्येक मास्टर शीशी 12 परीक्षण के लिए पर्याप्त अभिकर्मकों होता है.
- धीरे मास्टर शीशियों भंवर और त्वरित अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र में उन्हें स्पिन.
- एक शीशी में प्रत्येक मास्टर शीशी की सामग्री का मिश्रण है, और धीरे फिर भंवर.
- एक एकल बाँझ microfuge ट्यूब में पीसीआर वर्कशीट पर संकेत मात्रा में मास्टर मिश्रण और मिलीग्राम समाधान का मिश्रण.
- Quantitation मानक (क्यूएस) के लिए है, जो स्थिति 5 में केशिका छोड़कर, प्रत्येक केशिका ट्यूब में धीरे और विभाज्य मिलीग्राम के साथ मास्टर मिश्रण के 15 μl मिलाएं.
- स्वच्छ हुड से एक प्रसंस्करण हुड के लिए मिलीग्राम के साथ केशिका ट्यूब और मास्टर मिश्रण युक्त ठंडा ब्लॉक हटो.
- मास्टर की शेष 30 μl के लिए आंतरिक नियंत्रण के 2 μl (आईसी) जोड़ेंमिलीग्राम के साथ मिश्रण. स्थिति 5 में केशिका (क्यूएस के लिए स्थिति) में धीरे और विभाज्य 15 μl मिलाएं.
- पानी की पिपेट 10 μl, उचित केशिका ट्यूब में डीएनए, या नमूना डीएनए नियंत्रित करते हैं. कैपिंग उपकरण का उपयोग केशिका ट्यूब टोपी.
- वास्तविक समय पीसीआर साधन को ब्लॉक / नमूने ठंडा लो.
- सीएमवी परख रन के लिए एक एक्सेल पीसीआर वर्कशीट उत्पन्न करें. इस एक्सेल वर्कशीट मिलीग्राम के साथ मास्टर मिश्रण बनाने के लिए आवश्यक प्रत्येक अभिकर्मक की कुल राशि की गणना करता है. यह नमूना प्रति जरूरत प्रत्येक अभिकर्मक की राशि (नीचे सूचीबद्ध) टाइम्स नमूने और नियंत्रण की संख्या अधिक पलता एक (कारण pipetting को नुकसान की भरपाई करने के लिए).
- वास्तविक समय पीसीआर साधन कार्यक्रम (1 टेबल देखें)
- प्रवर्धन और पता लगाने वास्तविक समय पीसीआर साधन पर प्रदर्शन
- कंप्यूटर पर लॉग इन करें
- डबल साधन आइकन पर क्लिक करें और सॉफ्टवेयर में लॉग इन करें.
- वास्तविक समय पीसीआर साधन चालू करें
- सामने स्क्रीन से "सीएमवी / EBV" पर क्लिक करें.
- मैक्रो विज़ार्ड के संकेतों का पालन करें.
- सॉफ्टवेयर से प्रेरित जब एक आत्म परीक्षण चलाने के लिए बॉक्स का चयन करें. एक आत्म परीक्षण उपकरणों के इस्तेमाल में है हर दिन में एक बार किया जाना चाहिए.
- रन नाम.
- ऊपरी LEF में स्थित नमूना गिनती समायोजितनियंत्रण और मरीजों की राशि के लिए पृष्ठ के टी कोने दौड़ में शामिल है और प्रत्येक रोगी के नमूने की पहचान संख्या दर्ज करें.
- "पेट क्वांट" टैब पर क्लिक करें.
- "नमूना प्रकार" के तहत, मानक के लिए उपयुक्त नमूना प्रकार आवंटित.
- Quantitation मानक (क्यूएस) के लिए उम्मीद की सांद्रता में टाइप करें.
- कूलर ब्लॉक से केशिका ट्यूब निकालें और (ब्लॉक नमूना # 1 ठंडा आदि, हिंडोला पर स्थिति # 1 में रखा जाना चाहिए) हिंडोला में इसी स्थिति में उन्हें जगह है.
- साधन अपकेंद्रित्र और प्रेस शुरू में हिंडोला रखें.
- अपकेंद्रित्र खोलें और हिंडोला हटा दें.
- वास्तविक समय पीसीआर साधन में हिंडोला रखें. ढक्कन बंद करें.
- प्रेस "प्रारंभ भागो".
- वास्तविक समय पीसीआर साधन एक नमूना के लिए प्रत्येक स्थिति की जाँच करेगा. इस जाँच पूरी होने तक दूर साधन से चलना मत करो, खासकरकेशिकाओं से एक हिंडोला में नहीं है तो खासकर. साधन यह ध्यान दें और रन जारी रखा जा रहा है पूछना होगा. रवाना होने से पहले जवाब हाँ.
- रन पूरा होने के बाद उत्पन्न किया गया है कि रिपोर्ट को बंद करें.
- "निरपेक्ष Quantitation" पर क्लिक करें.
- अगले रंग मुआवजा के लिए तीर पर क्लिक करें.
- ड्रॉप डाउन बॉक्स से "रंग चुनें मुआवजा" पर क्लिक करें.
- रन के लिए लागू करने के लिए सबसे मौजूदा रंग मुआवजा फाइल चुनें.
- बॉक्स को चबूतरे जब ठीक क्लिक करें.
- मानक वक्र द्वारा तीर पर क्लिक करें.
- ड्रॉप डाउन मेनू से "बाहरी उपयोग" का चयन करें.
- सबसे वर्तमान बाह्य मानक वक्र फ़ाइल का चयन करें, तब ठीक क्लिक करें.
- एक एकाग्रता सौंपा है अगर घटता, वर्तमान और नहीं फ्लैट लाइन कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण मात्रा मेनू के तहत प्रत्येक वक्र को देखो. 705/Back 530 के लिए निरपेक्ष मात्रा स्वतः विश्लेषण किया है.
- Quality नियंत्रण
- अधिक अक्सर है, जो भी अभिकर्मकों की एक नई बहुत संख्या प्राप्त होता है जब भी एक नया मानक वक्र, या हर छह महीने में उत्पन्न करते हैं.
- मिलीग्राम के साथ मास्टर मिश्रण करने के लिए प्रत्येक स्तर के 10 μl जोड़ें. पहले से निकाले डीएनए के रूप में किट के साथ शामिल मानकों पर विचार करें.
- मिलीग्राम सटीक quantitation को आश्वस्त करने के क्रम में मानक वक्र पैदा करने में इस्तेमाल के साथ मास्टर मिश्रण करने के लिए प्रत्येक स्तर के लिए आंतरिक नियंत्रण की 1 μl जोड़ें. कोई खाका नियंत्रण (एनटीसी) के लिए मिलीग्राम के साथ मास्टर मिश्रण करने के लिए आईसी न जोड़ें.
- 16 डेटा बिंदुओं में कुल एक एनटीसी और quantitation मानक क्यु 4, 3, 2, 1, और मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए चलाने के लिए QS4 के 1:10 कमजोर पड़ने के तीन प्रतिकृति तैयार करें.
- दोहराया मानकों के लिए ड्रॉप डाउन मेनू में "की नकल" का चयन करें
- चैनल 530/back कोई भी चुनें और चलाने का विश्लेषण करते समय रंग मुआवजे पर बारी,
- "(भागो में) मानक वक्र" के तहत, "चयन पूर्व के रूप में सहेजतेहरा "और वक्र नाम है. जब बचत "मानक वक्र के रूप में लागू" टिप्पणी लिखें.
- परिणाम ग्राफ. परिणामस्वरूप linearity गुणांक 0.81 ≥ किया जाना चाहिए.
- दैनिक रनों के लिए, समय में एक नियंत्रण के रूप में QS3 या QS4 की एक प्रति शामिल हैं. वर्तमान बाह्य मानक वक्र विश्लेषण चरण के दौरान चलाने में आयात किया जा सकता है.
- भागो नियंत्रण: कोई डीएनए नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, कम, और उच्च सकारात्मक नियंत्रण. उम्मीद वायरल लोड निर्धारित करने और प्रत्येक विक्रेता और बहुत संख्या के लिए निकाला जाता है.
- प्रत्येक नमूने के लिए एक आईसी जोड़ें और डीएनए निष्कर्षण के दौरान नियंत्रित करते हैं.
- नियंत्रण के लिए किसी भी सीमा से बाहर आते हैं, अस्वीकार्य परिणाम रिकॉर्ड और समस्या निवारण के लिए परख देखें.
- नियंत्रण की आवृत्ति
- एक एनटीसी, नकारात्मक, कम सकारात्मक, सकारात्मक उच्च, और मानक नियंत्रण: हर समय में शामिल करें.
नोट: नियंत्रण के लिए स्वीकार्य सीमा. कोई चोटियों का पालन किया जाना चाहिएकोई टेम्पलेट (एनटीसी) और नकारात्मक नियंत्रण के लिए डी. चोटियों 530 चैनल में मौजूद होना चाहिए और उम्मीद वायरल लोड निर्धारित और निम्न और उच्च सकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रत्येक विक्रेता और बहुत संख्या के लिए समायोजित कर रहे हैं.
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Representative Results
228 ऊतक ब्लॉक के एक कुल गोलमोल सीएमवी आईएचसी साथ ऊतक विज्ञान और सकारात्मक immunohistochemistry (आईएचसी), 18 पर आधारित 91 cytomegalovirus (सीएमवी) पॉजिटिव मामलों का शामिल किया गया था जो मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR), और 79 नकारात्मक नियंत्रण द्वारा परीक्षण किया गया. चित्रा 2 में सचित्र, सीएमवी सकारात्मक मामलों ठेठ सीएमवी वायरल समावेशन (ए) और / या सकारात्मक आईएचसी धुंधला (बी) का प्रदर्शन किया जाएगा. नकारात्मक नियंत्रण कोई संदिग्ध ऊतक विज्ञान या आईएचसी धुंधला 5 दिखाया होता, जबकि गोलमोल मामलों, दुर्लभ, गैर क्लासिक दिखने धुंधला पैटर्न (सी) का प्रदर्शन किया जाएगा.
ऊतकविकृतिविज्ञानी द्वारा सीएमवी के लिए सकारात्मक 91 बायोप्सी की, 88 qPCR (तालिका 2) द्वारा सकारात्मक थे. पारंपरिक ऊतक विज्ञान पर आधारित एक सच्चे सकारात्मक परिभाषा के साथ, ठेठ सीएमवी वायरल समावेशन और / या ठेठ सीएमवी आईएचसी यानी, इन आंकड़ों 96.7% की संवेदनशीलता में हुई.
गोलमोल सीएमवी आईएचसी धुंधला के साथ 18 (78%) बायोप्सी के चौदह qPCR 5 द्वारा सीएमवी के लिए सकारात्मक परीक्षण किया गया. इन 18 गोलमोल मामलों के अलावा, ग्यारह अतिरिक्त बायोप्सी ऊतकविकृतिविज्ञानी द्वारा सीएमवी के लिए सकारात्मक थे कि उसी दिन लिया था. इन 14 qPCR सकारात्मक नमूने में, 10 बायोप्सी ऊतकविकृतिविज्ञानी पर सीएमवी के लिए सकारात्मक थे कि उसी दिन लिया था. का परीक्षण 18 गोलमोल बायोप्सी की, 11 बायोप्सी लिया गया था समय के 7 दिनों में या भीतर प्रस्तुत अन्य नमूनों पर सीएमवी परीक्षण के संबंध में अतिरिक्त नैदानिक जानकारी थी. इन 11 मामलों के अलावा, 8 (73%) qPCR द्वारा सीएमवी के लिए सकारात्मक परीक्षण किया गया. इन 11 बायोप्सी की, 5 (45%) अतिरिक्त सकारात्मक सीएमवी नमूनों के साथ qPCR द्वारा सकारात्मक परीक्षण किया; 3 (27%) मंज़ूर परीक्षण कियाकोई सकारात्मक सीएमवी नमूनों के साथ qPCR द्वारा ive; 3 (27%) अतिरिक्त नकारात्मक सीएमवी नमूनों के साथ qPCR द्वारा नकारात्मक परीक्षण किया गया.
उपर्युक्त उन पढ़ाई के अलावा, यह प्राप्त करने के अतिरिक्त hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के स्तर में कोई वायरल समावेशन शुरू में एच ई पर देखा और सीएमवी आईएचसी गोलमोल है, जहां मामलों में फायदेमंद होगा या नहीं यह निर्धारित करने के लिए ब्याज की थी. इसलिए, गोलमोल सीएमवी आईएचसी के साथ 18 ब्लॉकों में से प्रत्येक के लिए एच ई के स्तर से 5 बार प्रदर्शन किया गया. दो पैथोलॉजिस्ट ध्यान से इन मामलों की जांच की और अतिरिक्त स्लाइड्स (नहीं दिखाया डेटा) में से किसी पर नमूदार वायरल समावेशन की पहचान नहीं हो सकी.
| सुझाव वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन मापदंडों | ||||||
| सेटअप रीडिंग: | ||||||
| डिफ़ॉल्ट चैनल | तापमान की तलाश | अधिकतम स्थिति की शोध उपकरण का प्रकार | केशिका आकार | |||
| 530 | 30 डिग्री सेल्सियस | 12 | 6 चैनल | 20 μl | ||
| कार्यक्रम का नाम: एंजाइम के सक्रियण | ||||||
| चक्रों की संख्या: 1 | ||||||
| विश्लेषण मोड: कोई नहीं | ||||||
| लक्ष्य डिग्री सेल्सियस | HH पकड़ो: mm: ss | रैंप दर | सेक लक्ष्य | डग आकार | चरण देरी | अधिग्रहण मोड |
| 95 | 00:10:00 | 20 | 0 | 0 | 0 | कोई नहीं |
| कार्यक्रम का नाम: कदम टच डाउन | ||||||
| चक्रों की संख्या: 10 | ||||||
| विश्लेषण मोड: कोई नहीं | ||||||
| लक्ष्य डिग्री सेल्सियस | HH पकड़ो: mm: ss | रामपी दर | सेक लक्ष्य | डग आकार | चरण देरी | अधिग्रहण मोड |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | कोई नहीं |
| 65 | 00:00:20 | 20 | 55 | 1 | 1 | कोई नहीं |
| 72 | 00:00:15 | 20 | 0 | 0 | 0 | कोई नहीं |
| कार्यक्रम का नाम: डीएनए का प्रवर्धन | ||||||
| चक्रों की संख्या: 40 | ||||||
| विश्लेषण विधि: Quantitation | ||||||
| लक्ष्य डिग्री सेल्सियस | HH पकड़ो: mm: ss | रैंप दर | सेक लक्ष्य | डग आकार | चरण देरी | अधिग्रहण मोड |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | कोई नहीं |
| 55 | 00:00:20 | 20 | 0 | 0 | 0 | एक |
| 72 | 00:00:15 | 10 | 0 | 0 | 0 | कोई नहीं |
| कार्यक्रम का नाम: ठंडा | ||||||
| चक्रों की संख्या: 1 | ||||||
| विश्लेषण मोड: कोई नहीं | ||||||
| लक्ष्य डिग्री सेल्सियस | HH पकड़ो: mm: ss | रैंप दर | सेक लक्ष्य | डग आकार | चरण देरी | अधिग्रहण मोड |
| 40 | 00:00:30 | 20 | 0 | 0 | 0 | कोई नहीं |
तालिका 1. सूचीबद्ध मापदंडों cytomegalovi का पता लगाने के लिए वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन का सेट अप में लक्ष्य तापमान, चक्र संख्या, और चक्र लंबाई के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए formalin-तय, आयल एम्बेडेड जठरांत्र बायोप्सी में रस. इन मानकों साधन मॉडल और निर्माता के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
| प्रोटोकॉल पॉजिटिव मामलों | पीसीआर पॉजिटिव मामलों | संवेदनशीलता | प्रोटोकॉल नकारात्मक मामलों | पीसीआर नकारात्मक मामलों | Specitivity |
| 91 | 88 | 96.7% | 79 | 78 | 98.7% |
Formalin-तय, आयल एम्बेडेड जठरांत्र बायोप्सी में cytomegalovirus का पता लगाने में वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) की तालिका 2. संवेदनशीलता (96.7%) और विशिष्टता (98.7%). इस तालिका एट अल 5 McCoy से संशोधित किया गया है.
es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg "चौड़ाई =" 400 "/>
बायोप्सी ऊतक का एक 10 माइक्रोन मोटी अनुभाग कट जाता है चित्रा 1. कैसेट दबाना एक में सही ढंग से बैठा ऊतक ब्लॉक के साथ एक ठेठ सूक्ष्म) के रूप में यह एक microfuge ट्यूब सी को सौंप दिया है जो एक पुस्तक बी),) में रोल करने के लिए अनुमति दी है. बायोप्सी के ऊतकों के सभी पांच स्क्रॉल डीएनए निष्कर्षण के लिए एक एकल microfuge ट्यूब में रखा जाता है.
उम्मीद आईएचसी धुंधला पैटर्न (मूल दिखा सीएमवी के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग चित्रा 2.) Hematoxylin और तीर (मूल बढ़ाई 400X) से संकेत के रूप में प्रचुर मात्रा में, ठेठ सीएमवी समावेशन दिखा एक पेट के बायोप्सी के दाग खंड eosin. बी) एक बृहदान्त्र बायोप्सी बढ़ाई 400X).
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Discussion
कई प्रयोगशाला तरीकों सीरम विज्ञान, वायरल संस्कृति, आणविक viremia assays, बायोप्सी सामग्री के ऊतक विज्ञान, और, formalin-तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) बायोप्सी का हाल ही में प्रदर्शन के रूप में, आणविक assays सहित cytomegalovirus का निदान (सीएमवी) के संक्रमण, के लिए उपलब्ध हैं ऊतक 5,6. सीरम विज्ञान, निदान का एक मुख्य आधार है, एक बार ही मज़बूती से जोखिम की पहचान करता है और तीव्र सीएमवी संक्रमण 7 के साथ अच्छी तरह से मेल नहीं खाता. पारंपरिक और जल्दी प्रतिजन खोल शीशी दोनों वायरल संस्कृति,, बाद 8 के मामले में सबसे अच्छा 2-3 दिनों में, लंबा परख बार आड़े आती है. आण्विक viremia assays सबसे निगरानी उपचार प्रभावकारिता 9-11 के लिए संभावित साथ मात्रात्मक होने का फायदा होने, विकसित किया गया है. जठरांत्र (सैनिक) पथ के स्थानीय भागीदारी के लिए नैदानिक चिंता का विषय है दुर्भाग्य से, जब viremia assays प्रणालीगत भागीदारी को दर्शाते हैं और विशेष रूप से स्थानीय संक्रमण की पहचान नहीं है. इसलिए, जistology सैनिक पथ के सीएमवी संक्रमण की पहचान करने के लिए सोने के मानक किया गया है.
यह गंभीर संक्रमण के विकास के लिए उनके अधिक से अधिक जोखिम को देखते हुए सेल प्रत्यारोपण स्टेम / सक्रिय सैनिक पथ सीएमवी कीमोथेरेपी पर एचआईवी / एड्स के साथ उन लोगों के रूप में immunosuppressed रोगियों में संक्रमण,,, या अंग की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) सैनिक बायोप्सी 5 में सीएमवी पता लगाने के लिए एक बेहद संवेदनशील और विशिष्ट विधि है सूचना मिली थी. इसी तरह के परिणाम अन्य अध्ययनों 6 द्वारा समर्थित किया गया है.
प्रक्रिया के दौरान सभी कदम महत्वपूर्ण हैं, विशेष विचार के लायक है कि कुछ महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सूक्ष्म पर ऊतक प्रसंस्करण के दौरान यह ब्लेड नमूनों के बीच पार संक्रमण की संभावना को कम करने के लिए प्रत्येक नमूने के बीच स्विच किया जा आवश्यक है. इसी तरह, सूक्ष्म क्षेत्रों के परिशोधन ऊतक एक उपयुक्त क्लीनर आरईसी का उपयोग कर के साथ संपर्क में आ सकता हैसूक्ष्म निर्माता द्वारा ommended भी इस जोखिम कम हो जाएगा.
प्रोटोकॉल के दौरान एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम निकालने की प्रक्रिया और प्रवर्धन दोनों के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जो डीएनए निष्कर्षण के दौरान नमूने के लिए आंतरिक नियंत्रण आईसी (2.3 कदम) के अतिरिक्त है. आईसी का पता लगाने के चैनल 705 में होता है जबकि सीएमवी वायरस का पता लगाने, चैनल 530 में होती है क्योंकि आईसी के प्रवर्धन और पता लगाने, सीएमवी के प्रवर्धन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. प्रत्येक प्रयोगशाला आईसी के लिए एक स्वीकार्य सीमा स्थापित करना चाहिए. निकासी के बाद, डीएनए गुणवत्ता का मूल्यांकन करने की आवश्यकता नहीं है. दूसरे शब्दों में, डीएनए एकाग्रता की spectrophotometric दृढ़ संकल्प नियमित डीएनए अलगाव के बाद किया नहीं है. पूर्व डीएनए निष्कर्षण करने के लिए जोड़ा है, आईसी निकालने की प्रक्रिया के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. वैकल्पिक रूप से, आईसी के 1 μl मिलीग्राम शीशी के साथ प्रत्येक मास्टर मिश्रण में जोड़ा जा सकता है. मिलीग्राम के साथ मास्टर मिश्रण करने के लिए जोड़ा है, आईसी केवल एक प्रवर्धन ग के रूप में कार्य करता हैontrol.
यह भी जरूरी है कि अभिकर्मक की स्थापना के लिए (pipettes और सुझावों सहित) एक स्वच्छ हुड इस्तेमाल किया जा है कि सभी qPCR प्रतिक्रियाओं की स्थापना के दौरान. इस हुड के भीतर इसे चालाकी से किसी भी प्रवर्धन उत्पादों, यानी पोस्ट वास्तविक समय या पारंपरिक पीसीआर, नहीं होना चाहिए. ये प्रवर्धन उत्पादों aerosolized हो जाते हैं और झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए अग्रणी बाद में तैयार qPCR प्रतिक्रियाओं को दूषित कर सकता है. कई प्रयोगशालाओं भी गैर न्यूक्लिक एसिड अभिकर्मकों और नमूना जोड़ने के लिए एक दूसरे डाकू और उपकरण pipetting के लिए जहाँ तक designating डाकू और उपकरण के रूप में जाना और न्यूक्लिक एसिड नियंत्रित करते हैं. व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं सबसे अच्छा अपनी व्यक्तिगत जगह की कमी को देखते हुए क्या काम करता है तय करना होगा.
अप्रत्याशित परिणामों समस्या निवारण की प्रक्रिया के दौरान आवश्यक हो सकता है. एक नमूना के आईसी (यानी फ्लैट लाइन) के प्रवर्धन के कोई सबूत नहीं है, तो यह पहले मूल डीएनए extracti से qPCR प्रतिक्रिया दोहराने की सिफारिश की हैएक pipetting त्रुटि को सुनिश्चित करने पर नमूना प्रतिक्रिया तैयारी के दौरान घटित नहीं था. आईसी दोहराने प्रतिक्रिया पर एक फ्लैट लाइन में रहता है और शेष पर्याप्त बायोप्सी ऊतक है, तो एक दूसरे डीएनए निष्कर्षण निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान आईसी जोड़ने के प्रति जागरूक किया जा रहा है, का प्रदर्शन कर सकते हैं. यह फिर से निकाले नमूना भी एक फ्लैट लाइन आईसी दर्शाता है, यह मूल नमूना के भीतर मौजूद एक प्रतिक्रिया अवरोध करनेवाला है की संभावना है. QPCR प्रतिक्रिया नियंत्रण उचित प्रदर्शन नहीं किया था, क्योंकि इस मामले में, परीक्षा परिणाम सीएमवी का पता लगाने के लिए अनिश्चित हो जाएगा.
पानी, कोई लक्ष्य नियंत्रण (एनटीसी) के लक्ष्य के प्रवर्धन दर्शाता है, यह पहली बार चलाने की सकारात्मकता दर का विश्लेषण करने की सलाह दी है. रन सामान्य सकारात्मकता दर की तुलना में अधिक है, तो यह किसी भी अभिकर्मक हेरफेर किसी भी संभावित पर्यावरण प्रदूषण की पहचान करने के लिए किया जाता है जहां क्षेत्रों में कड़ी चोट परीक्षण करने की सिफारिश की जाएगी. पर्यावरण प्रदूषण की संभावना से इनकार कर रहा है, का उपयोग एकहमेशा की तरह सकारात्मक नियंत्रण के साथ साथ नए खुले पानी नियंत्रण. नए खुले पानी नियंत्रण एक प्रवर्धन उत्पाद प्रदर्शित नहीं करता है, यह पिछले जल नियंत्रण लक्ष्य अनुक्रम के साथ दूषित किया गया था की संभावना है. इस नए पानी नियंत्रण फिर से दूषित है, तो हालांकि, यह लक्ष्य अनुक्रम के साथ दूषित किया जा रहा अभिकर्मकों या डाकू के किसी एक या सभी की संभावना को जन्म देती है. इस मामले में, यह प्रक्रिया के दौरान सारे डाकू शुद्ध करना और फिर (सकारात्मक और पानी) नियंत्रण का एक नया सेट चलाने में सभी नए अभिकर्मकों उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा होगा. यदि समस्या बनी रहती है, प्रसंस्करण क्षेत्रों और डाकू में कार्यप्रवाह, साथ ही उत्पाद निर्माताओं से संपर्क करने का पुनर्मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
गुणवत्ता मानकों (क्यूएस) प्रवर्धन के दौरान उचित प्रतिलिपि संख्या को प्रदर्शित नहीं करते रन में शामिल हैं, तो यह सबसे पहले क्यु (4, 3, 2, 1, और QS4 के 1:10 कमजोर पड़ने) चलाने की सलाह दी है. इन मानकों को उचित सीमाओं के भीतर गिर जाते हैं, तो दोहरानेके रूप में पहले उचित नियंत्रण के साथ निर्दिष्ट नमूनों. क्यु उचित सीमाओं के भीतर गिर नहीं है, तो प्रोटोकॉल (3.4) के गुणवत्ता नियंत्रण खंड में वर्णित के रूप में एक नया मानक वक्र उत्पन्न करते हैं. समस्या बनी रहती है, वर्तमान या एक नए बहुत संख्या में नए खुले क्यु साथ एक नया मानक वक्र पैदा करने का प्रयास किया जा सकता है. इन चरणों का असफल रहे हैं, तो निर्माता से संपर्क warranted किया जाएगा.
सोने के मानक के रूप में (एच ई और आईएचसी) पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर की गणना के आधार पर सैनिक बायोप्सी में सीएमवी का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता और qPCR की विशिष्टता तुरंत सोने के मानक के रूप में अधिक विश्लेषणात्मक संवेदनशील qPCR विधि का उपयोग कर, एक नैदानिक लाभ का प्रदर्शन नहीं है, यद्यपि बहुत इन को बेहतर बनाता है गणना 5. साथ ही, 18 गोलमोल बायोप्सी के 14 (78%) इस अध्ययन में qPCR द्वारा सीएमवी के लिए सकारात्मक परीक्षण किया गया. यह इन बातों qPCR एच एंड किसी की तुलना में अधिक संवेदनशील है कि इस धारणा का समर्थन महसूस किया हैअकेले ई, या सैनिक बायोप्सी सामग्री में सीएमवी का पता लगाने में आईएचसी के साथ संयोजन के रूप में. इसके अतिरिक्त, गोलमोल आईएचसी धुंधला पैटर्न के साथ मामलों में, अतिरिक्त स्तर प्राप्त करने के मौजूदा मानक तरीकों की तुलना में किसी भी अतिरिक्त लाभ के होने की संभावना नहीं है.
साथ में ले ली, qPCR FFPE सैनिक बायोप्सी ऊतक में सीएमवी संक्रमण का पता लगाने के लिए बेहद संवेदनशील और विशिष्ट है. विशेष रूप से उपयोगी गोलमोल सीएमवी आईएचसी धुंधला पैटर्न या सीएमवी के लिए चिकित्सकीय अत्यधिक संदिग्ध के साथ सैनिक बायोप्सी पर qPCR का प्रदर्शन है. पारंपरिक ऊतक विज्ञान की तुलना में, सैनिक बायोप्सी सामग्री की qPCR परीक्षण इस प्रकार पहले और अधिक प्रभावी रोगी प्रबंधन के लिए अग्रणी, एक कम समय की अवधि में एक सही निदान की सुविधा हो सकती.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम आंकड़े तैयार करने में उनके प्रयासों के लिए इस पांडुलिपि तैयार करने के साथ उसकी सहायता के लिए एमी Thomasson, और फ्रेड्रिक Skarstedt और रयान क्रिस्टी को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
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