Abstract
Очень важно определить цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции в желудочно-кишечном тракта (ЖКТ) из пациентов с иммунодефицитом, учитывая их более высокий риск для развития тяжелой инфекции. Многие лабораторные методы для обнаружения ЦМВ-инфекции были разработаны, в том числе серологических, вирусной культуры и молекулярных методов. Часто эти методы отражают системный причастность к ЦМВ и не конкретно определить причастность местных тканей. Таким образом, обнаружение цитомегаловирусной инфекции в желудочно-кишечном тракте часто делается путем традиционного гистологии биопсии ткани. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание в сочетании с иммуногистохимии (IHC) остались устои рассмотрении этих биопсии. Н & Е и IHC иногда привести к атипичных (двусмысленных) моделей окрашивания, делая интерпретация трудно. Было показано, что количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) для ЦМВ успешно может быть выполнена на фиксированных формалином, парафин (FFPE) биопсии ткани для оченьВысокая чувствительность и специфичность. Целью этого протокола является продемонстрировать, как выполнить тестирование КПЦР для обнаружения ЦМВ в FFPE биопсии ткани в клинических лабораторных условиях. Этот метод, вероятно, будет весьма полезным для пациентов в случаях двусмысленной окрашивания для ЦМВ в GI биопсии.
Introduction
Интерпретация цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции в клинических образцах является критически важным. ЦМВ является членом Betaherpesvirinae подсемейства герпесвирусов. Как и в других герпесвирусов, ЦМВ имеет возможность установить постоянный или латентной инфекции характеризуется отсутствием активной репликации вируса 1. Повторная активация вируса может произойти во время стресса или другого иммуносупрессии, что приводит к активной репликации вируса характеризуется вириона релиза, который могут сопровождать проявлений болезни 2-4. Желудочно-кишечные (GI) симптомы ЦМВ заболевания часто включают боль в животе и / или Кровавый стул 1.
Диагноз ЦМВ гастроэнтерита по гистологии использует гематоксилином и эозином (H & E) для выявления ЦМВ вирусных включений. В случаях, когда не высокая, но наблюдаются никаких очевидных включений клиническое подозрение, иммуногистохимия (IHC) часто используется в качестве адъюнкт-метода испытания. Тем не менее, IHCтакже может быть затруднено редких неклассических появляющихся моделей сотовых окрашивания (двусмысленных), что делает толкование трудно (рис. 2) 5. Было стремились использовать ДНК, выделенной из фиксированных формалином, парафин (FFPE) Г.И. биопсии ткани и количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) для обнаружения ЦМВ в GI биопсии. Эта техника была показано, что ценно в обнаружении ЦМВ в GI биопсии, и особенно полезно в двусмысленных IHC окрашивания случаях 5,6. Кроме того, КПЦР Также было показано, хорошо коррелирует с клинической дополнительной тестовых данных CMV, когда это доступно 6. Использование кПЦР в обнаружении ЦМВ может привести к ранней диагностике и лечения в тех случаях, когда клинические признаки ЦМВ является высокой, но H & E и ЦМВ IHC отрицательны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
С одобрения Institutional Review Board в, поиск электронного лабораторного базе данных было проведено с целью определить формалином парафиновых (FFPE) блокирует представляющие случаи цитомегаловируса (ЦМВ) инфекции в желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) биопсии диагнозом гистопатологией (гематоксилином и эозином (H & E) и / или иммуногистохимия (IHC)).
1. Тканей Обработка от FFPE Г.И. Биопсия ткани
- Сбор FFPE GI биопсия тканей блоки для цитомегаловируса (ЦМВ) количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР). Эти блоки хранили при комнатной температуре.
- Предварительно метка 1,7 мл микроцентрифужные пробирки с уникальным идентификационным номером блока.
- Зафиксируйте микротоме маховик.
- Установив блок тканей в кассетный зажим.
- Использование абсолютно чистую лезвие, выровнять блок в угол ножа на микротоме.
- Отрегулируйте микротом сократить толщиной 10 мкм разделы.
- Разблокировать тыс.э маховик и заранее блок к лезвию.
- Отрежьте 5 секций блока в 10 мкм толщиной интервалами, что позволяет каждому вырезать свернуть в свиток ткани. Убедитесь, что каждый свиток содержит адекватного представительства желаемых биопсии тканей.
- Зафиксируйте микротоме маховик.
- С щипцов, разместить все 5 свитки ткани в предварительно меченных трубки центрифуги, будьте осторожны, чтобы только управлять свиток на парафин, чтобы уменьшить потенциал для перекрестного загрязнения. Привязать крышку на трубе и поместить его обратно на полку.
- Снимите блок тканей от микротоме.
- Снимите и выбросьте лезвие.
- Дезактивации любых поверхностей или инструментов, которые могли вступать в контакт с предыдущим ткани.
- Наведите абсолютно чистую лезвие в держатель ножа.
- Повторите шаги 1.4-1.14 для каждого дополнительного блока должны быть обработаны. Микроцентрифуге трубки, содержащие ткани прокручивается можно хранить при комнатной температуре до ВММе экстракции ДНК.
2. Добыча ДНК из свитков из FFPE Г.И. Биопсия ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из пакета вставки ткани ДНК извлечения комплекта FFPE (Осторожно: См. Материал Паспорт безопасности (MSDS)).
- Добавить 1 мл ксилол (Осторожно: См. паспорт безопасности) для каждого образца пробирке. Закройте крышку и вихрь энергично в течение 10 сек.
- Продолжайте выделения ДНК, как конкретно изложенной в вставки продукции производителя со следующими изменениями.
- Сначала добавьте 6 мкл внутреннего контроля (IC) для каждой пробирке.
- После ATL / протеиназой К лизиса инкубации при 56 ° С в течение 1 ч, инкубировать при 99 ° С в течение 30 мин, а не 90 ° C в течение 1 часа.
- На заключительном этапе элюции ДНК, тщательно открыть крышку колонны очистки ДНК и применять 50 мкл дистиллированной ДНКазы / РНКазы свободной воды в центре мембраны, а не Buffeг ATE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Вставка пакета для соответствующего хранения и приготовления реагентов. ДНК должны быть извлечены из всех 5 FFPE свитков. Выполните все шаги центрифугирования при комнатной температуре (15-25 ° C).
3. КПЦР для ЦМВ
- Полимеразной цепной реакции (ПЦР) Процедура
- Создать электронную таблицу ПЦР Excel для серии анализов ЦМВ. Этот лист Excel вычисляет общее количество каждого реагента, необходимого для составляют основной смеси с Mg. Это умножает количество каждого реагента, необходимого на образец (перечислены ниже), умноженным на число образцов и контролей плюс один (для компенсации потерь, связанных с отбором,).
- Включить следующие реагенты в каждой реакции ПЦР в размере указано:
Реагент0; Количество в образце
ЦМВ LC Master Mix флакон 12,5 мкл
Mg Решение желтые флакон 2,5 мкл
Общий объем 15,0 мкл
- Включить следующие реагенты в каждой реакции ПЦР в размере указано:
- Включите в каждом тесте, запустить воду или нет целевой контроль (NTC), отрицательный контроль, низкий положительный контроль, высокий положительный контроль, и либо QS3 или QS4, и все образцы пациентов. Капилляры должны быть созданы в этом порядке.
- Получить охлаждения блокировать определенные для ПЦР в реальном времени инструмент, который хранится при температуре 4 ° C. Поместите соответствующие капиллярных трубок в охлаждающей блока. Не прикасайтесь к поверхности капилляров. Всегда используйте перчатки при работе капилляры.
- Устанавливает все полимеразной цепной реакции в чистом капотом не загрязненных усиления произц.
- Удалить правильное количество мастер-флаконах из комплекта ПЦР для проверки всех образцов пациентов, плюс 5 управления. Пусть мастер пузырьки, решение Mg и ПЦР класса оттепель вода в охлаждающей блока. Каждый мастер флакон содержит достаточно реагенты для 12 тестов.
- Аккуратно вихрь мастер пузырьки и быстро вращать их в центрифуге при максимальной скорости.
- Объединить содержимое каждого мастер флакона в одном флаконе, и мягко вихрь снова.
- Объедините основной смеси и раствора Mg в указанных количествах на листе ПЦР в единый стерильной пробирке.
- Осторожно перемешать и аликвоты по 15 мкл мастер-микс с Mg в каждый капилляр, за исключением капилляра в положении 5, который является для стандарта количественного (QS).
- Перемещение охлаждения блок, содержащий капиллярные трубки и мастер смеси с Mg от чистой капотом на перерабатывающую капотом.
- Добавить 2 мкл внутреннего контроля (ИС) на оставшиеся 30 мкл мастерасмешать с Mg. Осторожно перемешать и аликвоты по 15 мкл в капилляр в положении 5 (положение для QS).
- Внесите 10 мкл воды, контролировать ДНК или образец ДНК в соответствующий капиллярной трубки. Закройте капиллярные трубки, используя укупорки инструмент.
- Возьмите охлаждения блок / образцы в ПЦР в реальном времени инструмент.
- Создать электронную таблицу ПЦР Excel для серии анализов ЦМВ. Этот лист Excel вычисляет общее количество каждого реагента, необходимого для составляют основной смеси с Mg. Это умножает количество каждого реагента, необходимого на образец (перечислены ниже), умноженным на число образцов и контролей плюс один (для компенсации потерь, связанных с отбором,).
- Запрограммировать ПЦР в реальном времени инструмент (см. таблицу 1)
- Амплификации и детекции выполнена на ПЦР в реальном времени инструмента
- Войдите в компьютер
- Дважды щелкните на пиктограмме инструмента и войти в программу.
- Включите ПЦР в реальном времени инструмент
- Нажмите на кнопку "CMV / EBV" от переднего экрана.
- Следуйте подсказкам на макро мастера.
- Установите флажок для запуска самотестирования при запросе с помощью программного обеспечения. Самотестирования необходимо выполнить один раз каждый день прибор находится в использовании.
- Назовите перспективе.
- Отрегулируйте количество образца, расположенную в верхнем ЛЕФт углу страницы сумме управления и пациентов, включенных в перспективе и введите идентификационный номер каждого образца пациента.
- Перейдите на вкладку "Абс Квант".
- В разделе "типа Sample", назначить соответствующий тип выборки для стандарта.
- Введите в ожидаемых концентраций для стандарта количественного (QS).
- Удалить капиллярные трубки охладительный блок и поместить их в соответствующем положении в карусели (охлаждение блока выборки № 1 должны быть помещены в позиции № 1 на карусели и т.д.).
- Поместите карусель в центрифуге и пресс-начала инструмента.
- Откройте центрифугу и снимите карусель.
- Поместите карусель в ПЦР в реальном времени инструмента. Закройте крышку.
- Нажмите кнопку "Пуск Выполнить".
- ПЦР в реальном времени прибор будет проверять каждую позицию для образца. Не уходи от инструмента до эта проверка не была завершена, особенно если один из капилляров не в карусели. Прибор внимание, это и спросить, если пробег должен быть продолжен. Перед отъездом Ответ да.
- После выполнения завершена, закройте отчет, который был создан.
- Нажмите на кнопку "Абсолютной количественного".
- Нажмите на стрелку рядом с Color компенсации.
- Нажмите кнопку "Выбрать цвет Компенсация" из выпадающего списка.
- Выберите наиболее текущий файл компенсации цвет обратиться в перспективе.
- Нажмите OK, когда появляется окно.
- Нажмите на стрелку по стандартной кривой.
- Выберите "использовать внешний" из меню раскрывающегося списка.
- Выберите самую последнюю внешний файл стандартной кривой, нажмите кнопку ОК.
- Посмотрите на каждой кривой в меню абсолютного количественного чтобы убедиться, что кривые присутствуют, а не плоская линия, если концентрация присваивается. Абсолютного количественного для 705/Back 530 автоматически анализируется.
- Цюйконтроль Эк
- Создать новую стандартную кривую, когда новый номер партии реагентов полученную или каждые шесть месяцев, в зависимости от того является более частыми.
- Добавить 10 мкл каждого стандарта на мастер-микс с Mg. Рассмотрим стандарты, включенные в наборе как с ранее выделенным ДНК.
- Добавить 1 мкл внутреннего контроля для каждого стандарта в мастер-микс с Mg, используемого в производстве стандартной кривой для того, чтобы заверить точно оценить. Не добавляйте IC к мастер-микс с Mg для никакого контроля шаблонов (NTC).
- Подготовка NTC и трех повторностей количественного стандартам QS 4, 3, 2, 1 и разведении 1:10 на QS4 для выполнения, чтобы генерировать стандартной кривой, на общую сумму в 16 точек данных.
- Выберите "Перенос из" в выпадающем меню для повторных стандартам
- Выбирать канала 530/back ни и включите компенсации цвета при анализе бег,
- Под "калибровочной кривой (в беге)", выберите "сохранить как эксвнешнего "и назовите кривую. Введите комментарий "применяется как стандартной кривой" при сохранении.
- Граф результаты. В результате коэффициент линейности должны быть ≥ 0,81.
- Для ежедневных пробегов, включают одну копию QS3 или QS4 в качестве контроля в бегах. Нынешний внешний стандарт кривая может быть импортирован в перспективе на этапе анализа.
- Запуск Управление: нет контроля ДНК, отрицательный контроль, низкие и высокие положительные элементы управления. Ожидаемый вирусная нагрузка определяется и регулируется для каждого поставщика и номер партии.
- Добавить IC для каждого образца и контроля во время экстракции ДНК.
- Если любой из элементов управления выпадают из диапазона, записывать неприемлемые результаты, отсылая анализ для устранения неполадок.
- Частота контроля
- Включите в каждом счете: NTC, отрицательный, слабоположительного, высокая положительная, и стандарт управления.
Внимание: допустимые пределы для контроля. Нет пики не следует заметитьг для не шаблон (NTC) и отрицательных контролей. Пики должны присутствовать в 530 канала и ожидаемые вирусные нагрузки определяются и корректируются для каждого поставщика и номер партии для низких и высоких положительных контролей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В общей сложности 228 блоков ткани были испытаны с помощью количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР), который состоял из 91 цитомегаловируса (CMV) положительных случаев на основе гистологии и иммуногистохимии положительной (IHC), 18 с сомнительного CMV IHC и 79 отрицательных контролей. Как показано на рисунке 2, ЦМВ положительных случаев будет продемонстрировали типичные CMV вирусных включений (A) и / или положительный IHC окрашивание (B). Сомнительные случаи будут продемонстрировали редкие, не-классические появляющиеся шаблоны окрашивания (C), в то время как отрицательный контроль не показал бы никаких подозрительных гистологию или IHC окрашивание 5.
Из 91 биопсий положительных для ЦМВ гистопатологией, 88 были положительными КПЦР (табл. 2). С истинной положительной определение, основанное на традиционной гистологии, т.е. типичные CMV вирусных включений и / или типичный ЦМВ IHC, эти данные привели к чувствительности 96,7%.
Четырнадцать из 18 (78%) биопсий с двусмысленной окрашивания ЦМВ IHC дали положительный результат на ЦМВ КПЦР 5. Среди этих 18 двусмысленных случаях, одиннадцать были дополнительные биопсии приняты в тот же день, что были положительны для ЦМВ гистопатологией. Среди этих 14 положительных проб КПЦР, 10 имели биопсии приняты в тот же день, что были положительны для ЦМВ на гистопатологии. Из 18 двусмысленных биопсии проверенных, 11 имели дополнительную клиническую информацию о ЦМВ тестирования на других образцов, представленных на или в течение 7 дней с момента биопсия взят. Среди этих 11 случаев, 8 (73%) дали положительный результат на ЦМВ КПЦР. Из этих 11 биопсий, 5 (45%) оказались положительными КПЦР с дополнительными положительных образцов ЦМВ; 3 (27%) оказались POSITив КПЦР без каких-либо положительных образцов ЦМВ; 3 (27%) дали отрицательный результат КПЦР с дополнительными негативными ЦМВ образцов.
В дополнение к этим исследований, упомянутых выше, было интересно определить, является ли получение дополнительных гематоксилином и эозином (H & E) уровнях будет полезно в случаях, когда отсутствуют вирусные включения не видны на H & E изначально и ЦМВ IHC сомнительны. Таким образом, H & E уровни раз 5 для каждой из 18 блоков с двусмысленной ЦМВ IHC проводились. Два патолога внимательно осмотрел эти случаи и не смог определить заметных вирусных включений на любой из дополнительных слайдов (данные не представлены).
| Предлагаемые в режиме реального времени параметры полимеразной цепной реакции | ||||||
| Настройка чтения: | ||||||
| По умолчанию канал | Ищите температура | Макс Ищите Поз Тип инструмента | Капиллярной Размер | |||
| 530 | 30 ° C | 12 | 6-канальный | 20 мкл | ||
| Название программы: Активация фермента | ||||||
| Количество циклов: 1 | ||||||
| Не Режим анализа: Ни | ||||||
| Целевая ° C | Держите чч: мм: сс | Рампа Оценить | Сек Целевая | Размер шага | Шаг задержки | Режим Приобретение |
| 95 | 0:10:00 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ни один |
| Название программы: Касание льда шаг | ||||||
| Количество циклов: 10 | ||||||
| Не Режим анализа: Ни | ||||||
| Целевая ° C | Держите чч: мм: сс | Овенр Оценить | Сек Целевая | Размер шага | Шаг задержки | Режим Приобретение |
| 95 | 0:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ни один |
| 65 | 0:00:20 | 20 | 55 | 1 | 1 | Ни один |
| 72 | 0:00:15 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ни один |
| Название программы: амплификации ДНК | ||||||
| Количество циклов: 40 | ||||||
| Режим анализа: Количественное | ||||||
| Целевая ° C | Держите чч: мм: сс | Рампа Оценить | Сек Целевая | Размер шага | Шаг задержки | Режим Приобретение |
| 95 | 0:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ни один |
| 55 | 0:00:20 | 20 | 0 | 0 | 0 | Один |
| 72 | 0:00:15 | 10 | 0 | 0 | 0 | Ни один |
| Название программы: Охлаждение | ||||||
| Количество циклов: 1 | ||||||
| Не Режим анализа: Ни | ||||||
| Целевая ° C | Держите чч: мм: сс | Рампа Оценить | Сек Целевая | Размер шага | Шаг задержки | Режим Приобретение |
| 40 | 0:00:30 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ни один |
Таблица 1. Параметры, перечисленные должны использоваться в качестве ориентира для целевых температурах, номера цикла, и длинами циклов в настройки в режиме реального времени полимеразной цепной реакции для обнаружения cytomegalovi рус в фиксированных формалином, парафин желудочно-кишечных биопсии. Эти параметры могут потребовать оптимизации в зависимости от модели прибора и производителя.
| Гистологии положительных случаев | ПЦР положительные случаи | Чувствительность | Гистологии негативных случаев | ПЦР отрицательные случаи | Specitivity |
| 91 | 88 | 96,7% | 79 | 78 | 98,7% |
Таблица 2. Чувствительность (96,7%) и специфичность (98,7%) в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) при обнаружении цитомегаловируса в фиксированных формалином, парафин желудочно-кишечных биопсии. Эта таблица была и др. 5 редактировался Маккой.
es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg "ширина =" 400 "/>
Рисунок 1. Типичный микротом с блоком ткани правильно вставлена в кассетный зажим A) в виде густого раздел 10 микрон из биопсии ткани разрезают разрешается скатать в прокрутки B), который передается в пробирке C). Все пять свитки биопсии ткани помещаются в одной пробирке для выделения ДНК.
Рисунок 2.) Гематоксилином и эозином окрашенные разрез толстой кишки биопсии показывая обильные, характерные включения CMV как показано стрелками (исходное увеличение 400X). Б) толстой кишки биопсия окрашивали моноклональных антител против ЦМВ, показывая ожидаемую IHC окрашиванием (оригинальный увеличение 400X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многие лабораторные методы доступны для диагностики цитомегаловируса (ЦМВ) инфекции, в том числе серологических, вирусной культуры, молекулярных анализов виремии, гистологии материале биопсии, и, как недавно продемонстрировали, молекулярных анализов фиксированные формалином, парафин (FFPE) биопсии ткани 5,6. Серология, как только основой диагностики, только надежно указывают, что экспозиция и не хорошо коррелируют с острой ЦМВ-инфекции 7. Вирусный культура, как обычных, так и в начале антиген оболочки флакон, затрудняется длительному времени анализа, в лучшем случае 2-3 дней в случае последнего 8. Молекулярные виремии анализы были разработаны, большинство имеющих преимущество в том, количественный с потенциалом для наблюдения за эффективностью лечения 9-11. К сожалению, когда имеются клинические забота о местном участии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), виремии анализы отражают системное вовлечение и не конкретно определить локализованную инфекцию. Таким образом, чistology был золотым стандартом для выявления ЦМВ-инфекции в желудочно-кишечном тракте.
Это имеет решающее значение для идентификации активных CMV ЖКТ инфекции в ослабленным иммунитетом пациентов, таких как те с ВИЧ / СПИДом, на химиотерапии или орган / пересадки стволовых клеток, учитывая их более высокий риск для развития тяжелой инфекции. Было сообщено, количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) является высокочувствительным и специфическим методом для обнаружения ЦМВ в GI биопсий 5. Аналогичные результаты были поддержаны другими исследованиями 6.
Хотя все шаги на протяжении всей процедуры важны, есть несколько ключевых важных шагов, которые заслуживают особого внимания. В процессе обработки ткани на микротоме, крайне важно, лезвие переключаться между каждого образца, чтобы уменьшить возможность перекрестного загрязнения между образцами. Точно так же, дезактивация участков на микротоме ткань, возможно, вступают в контакт с использованием соответствующего чистого RECдуется производителем микротома также снизить этот риск.
Дополнительным важным шагом в процессе протокола является добавление внутреннего контроля IC (этап 2.3) к образцу во время экстракции ДНК, который действует в качестве контроля для процесса экстракции и амплификации. Амплификации и детекции ИС не мешает амплификации ЦМВ, так как обнаружение вируса CMV происходит в канале 530, в то время как обнаружение IC происходит в канале 705. Каждая лаборатория должна установить приемлемый диапазон для IC. После экстракции, качество ДНК не должны быть оценены. Другими словами, спектрофотометрическое определение концентрации ДНК не выполняется обычно следующее выделения ДНК. Если добавлены до выделения ДНК, IC действует в качестве контроля для процесса экстракции. В качестве альтернативы, 1 мкл IC могут быть добавлены к каждому мастер-смеси с Mg флаконе. Если добавлены в смеси с мастер-Mg, IC действует только как амплификации сontrol.
Важно также, что в ходе настройки всех реакций КПЦР, что чистый капот (в том числе пипеток и наконечников) быть использованы для реагента настроить. Это капот не должно быть никаких продуктов амплификации, т.е. сообщению в реальном времени или обычной ПЦР, манипулировать внутри него. Эти продукты амплификации может стать аэрозольный и загрязнять впоследствии подготовленные КПЦР реакции, приводящие к ложным положительным результатам. Многие лаборатории даже пойти так далеко, как, обозначающих капюшонами и оборудования для пипетки реагенты без нуклеиновых кислот и второй капот и оборудование для добавления образца и контролировать нуклеиновой кислоты. Отдельные лаборатории должны решить, что лучше всего работает с учетом их индивидуальных пространственных ограничений.
Поиск и устранение неисправностей неожиданные результаты могут быть необходимы во время процедуры. Если нет доказательств усиления IC (т.е. плоским линия) образца, рекомендуется сначала повторить реакцию КПЦР от первоначального extracti ДНКна для обеспечения ошибку пипетирующее не произошло в течение подготовки пробы реакции. Если IC остается на плоском линии на реакцию повторной и имеется достаточно биопсии ткани остальные, второй экстракции ДНК может выполняться, быть внимательным, чтобы добавить IC во время процесса экстракции. Если этот повторно экстрагируют образец также демонстрирует плоскую линию IC, вполне вероятно, происходит реакция ингибитор присутствует в исходном образце. В этом случае результат теста был бы неопределенными для обнаружения ЦМВ, так как контроль реакции КПЦР не выполняет надлежащим образом.
Если вода, ни одна цель управления (NTC) не демонстрирует усиление цели, то сначала необходимо проанализировать скорость положительности перспективе. Если прогон имеет выше, чем обычной скоростью положительности, он будет рекомендован для выполнения салфетки испытания районах, где любые манипуляции реагент выполняемых для выявления любого потенциального загрязнения окружающей среды. Если загрязнение окружающей среды исключено, используйтеНедавно открытый водный контроль наряду с обычными положительного контроля. Если элемент управления недавно открытый вода не показывает продукта амплификации, вполне вероятно, предыдущий контроль воды был загрязнен последовательности-мишени. Однако, если это новое управление вода снова загрязнена, это повышает возможность любой или все реагенты или капюшоны быть загрязненными последовательности-мишени. В этом случае, было бы лучше для обеззараживания все капюшоны, используемые в процессе, а затем использовать все новые реагенты в управлении новый набор элементов управления (положительный и воды). Если проблема не устраняется, переоценка рабочего процесса в области обработки и капюшонах, а также связавшись с производителями продукции должно быть сделано.
Если стандарты качества (QS), включенных в перспективе не демонстрируют соответствующее количество копий при усилении, то рекомендуется сначала запустить все QS (4, 3, 2, 1 и разведение QS4 1:10). Если эти стандарты подпадают соответствующих диапазонов, а затем повторитеобразцы, как ранее указанные с соответствующим контролем. Если QS не подпадают соответствующих диапазонов, а затем создать новую стандартную кривую, как описано в разделе контроля качества протокола (3.4). Если проблема не устраняется, генерируя новый стандартную кривую с вновь открытых QS текущего или ряда новой партии может быть предпринято. Если эти действия окажутся безрезультатными, обратившись к производителю будет оправданным.
Хотя чувствительность и специфичность кПЦР для обнаружения ЦМВ в GI биопсии основаны на расчетах с использованием традиционных методов (H & E и IHC) как золотой стандарт не сразу продемонстрировать диагностическое преимущество, используя более аналитически чувствительный метод КПЦР как золотой стандарт значительно повышает их расчеты 5. Кроме того, 14 (78%) из 18 двусмысленных биопсии дали положительный результат на ЦМВ КПЦР в данном исследовании. Есть мнение, эти точки поддерживают идею о том, что КПЦР является гораздо более чувствительны, чем любой H &Одни Е, или в сочетании с IHC в обнаружении ЦМВ в GI биопсийного материала. Кроме того, в случаях с двусмысленных IHC моделей окрашивания, получения дополнительных уровней вряд ли будет какой-либо дополнительной выгоды по сравнению с существующими методами стандартных.
Взятые вместе, КПЦР является высокой чувствительностью и специфичностью для выявления ЦМВ-инфекции в FFPE GI биопсии ткани. Особенно полезно производительность QPCR по GI биопсии с двусмысленных ЦМВ IHC моделей окрашивания или клинически очень подозрительно для ЦМВ. По сравнению с традиционными гистологии, КПЦР тестирование Г.И. биопсийного материала может способствовать точный диагноз в течение короткого периода времени, что приводит к более раннее и более эффективное управление пациент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем, Эми Томассон за помощь с подготовкой эту рукопись, и Фредрик Скарстедт и Райан Кристи за их усилия по подготовке фигур.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
