Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie
Summary
De toepassing van matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF) massaspectrometrie (MS) rechtstreeks bloed kweekbouillon versnelt de identificatie van bacteriën. De onderhavige methode is een snelle en betrouwbare methode voor de identificatie van Gram-negatieve bacteriën direct uit bloed kweekbouillon.
Abstract
Een belangrijke rol van de klinische microbiologie laboratorium is om een snelle identificatie van bacteriën die bloedbaan infectie. Traditionele identificatie vereist de sub-cultuur van gesignaleerd bloedkweek bouillon met identificatie alleen beschikbaar nadat kolonies op vaste agar hebben gerijpt. MALDI-TOF MS is een betrouwbare, snelle werkwijze voor identificatie van de meeste klinisch relevante bacteriën wanneer toegepast op kolonies op vaste media. De toepassing van MALDI-TOF MS direct naar bloedkweek bouillon is een aantrekkelijke aanpak, omdat het heeft potentieel om species identificatie van bacteriën versnellen en verbeteren van klinische behandeling. Echter, een belangrijk probleem te overwinnen is de pre-analyse verwijdering van storende harsen, eiwitten en hemoglobine in bloedkweek specimens die, indien niet verwijderd, interfereren met de MS-spectra en kan leiden tot onvoldoende of lage discriminatie identificatie scores. Bovendien moet bacter concentrerenia te ontwikkelen spectra van voldoende kwaliteit. De gepresenteerde methode beschrijft de concentratie, zuivering en extractie van Gram-negatieve bacteriën waardoor de vroegtijdige identificatie van bacteriën uit een gesignaleerd bloedkweek bouillon.
Introduction
Patiënten met een infectie in de bloedbaan (BSI) als gevolg van bacteriën blijven hoog sterftecijfer in het ziekenhuis hebben, variërend 6-48% 1. De levering van geschikte empirische antibiotica bevordert de overleving en de subgroep van patiënten met ernstige sepsis, elk uur vertraging passende therapie correleert met verminderde overleving 2,3. Dienovereenkomstig is een belangrijke doelstelling van het klinisch laboratorium is om snel te detecteren, identificeren en communiceren van de aanwezigheid van bacteriën in het bloed culturen om klinische beslissingen. Het is aangetoond dat de microbiologie laboratorium heeft de grootste invloed op antimicrobiële therapie bij de rapportage van de Gramkleuring 4 en recent een waarnemingsstudie aangetoond dat matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) direct uitgevoerd op bloed kweeksuspensies beïnvloeden voorschrijven in meer dan een derde van de BSI veroorzaakt door Gram-negatieve bacteriën 5.
<p class="Jove_content"> De commerciële ontwikkeling van MALDI-TOF MS heeft geleid tot een effectieve laboratorium hulpmiddel voor de identificatie van micro-organismen 6,7. De technologie is nu goed ingeburgerd en is geïntegreerd in veel laboratoria voor snelle en accurate identificatie van micro-organismen die op vaste media 6,8. De directe toepassing van MALDI-TOF MS bloed cultuur (BC) bouillon die voor micro-organismen beroep op zowel clinici en laboratorium managers vanwege de potentie om een snellere identificatie van micro-organismen tegen een lage prijs te krijgen "positief" zijn gesignaleerd.De klinische bruikbaarheid van directe toepassing van MALDI-TOF MS om bloed cultuurbouillon is beperkt door de brede waaier van gevoeligheden waargenomen in vergelijking met standaard fenotypische cultuur gebaseerde methoden van identificatie, met meldingen van succesvolle identificatie van Gram-negatieve bacteriën, variërend 47-98,9 % 9-11. De variatie in gevoeligheid waarschijnlijkebetreft de BC bouillon samenstelling, aanvankelijk bacteriële concentratie variatie monstervoorbereiding en de talloze gramnegatieve organismen aangetroffen in onderzoekspopulatie 9. Vergeleken met deze andere gepubliceerde protocollen de hier gepresenteerde werkwijze vermijdt het gebruik van ethanol, ammoniumchloride of extra (niet-matrix) acetonitril. Als gevolg van de bacteriële pellet levensvatbaar blijft (tot het tijdstip eiwitextractie) waardoor potentiële fenotypische gevoeligheid testmethoden rechtstreeks worden toegepast op deze organismen in bouillon. Daarnaast heeft de gepresenteerde methode getoond goedkoop, betrouwbaar en snel met bacteriële identificatiemiddelen bestaan binnen 25 minuten van de bloedkweek Gramkleuring resultaten met minimale praktijkervaring op tijd 12 zijn.
Deze werkwijze is een eenvoudige eigen rotatie-lysis protocol gebruik mierenzuur extractie direct op positieve bloedkweek bouillon door Gram negatieve b identificerenBacteriën met MALDI-TOF MS technologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is van belang bij de toepassing van MALDI-TOF MS om bloed cultuurbouillon dat de post centrifugeren stappen worden uitgevoerd met voldoende zorg niet aan de gescheiden componenten te remixen. Het is bijzonder belangrijk om de bestanddelen bloedkweek en menselijke cellulaire eiwitten, zoals hemoglobine, die spikes interfereren met de MALDI-TOF spectra kunnen veroorzaken te verwijderen.
Hoewel MS produceert raden afgesneden score van ≥ 2,0 voor soorten en ≥ 1,7 voor genus identificatie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
Riferimenti
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod’hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
