إنتاج وعزل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية لتحليل الكيمياء الحيوية باستخدام مرشحات المسامية
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
المقصورة محور عصبي من الخلايا العصبية يظهر على درجة كبيرة من الاستقلال الوظيفي من المقصورة-somato شجيري. في الخلايا العصبية الإسقاط، محاور عصبية تحتوي على أكثر من البروتين 1،2 العصبية. اكتسبت دراسة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من المحاور الزخم في المجتمع الأعصاب بسبب وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الخلل في وقت مبكر محور عصبي يبدو أن هناك سمة مشتركة بين الأمراض العصبية والاضطرابات العصبية والنفسية 3. يبدو من المرجح أن فهم أفضل لآليات محور عصبي الحصري في الظروف العادية والمرضية وتسليط الضوء على الأحداث في وقت مبكر التي تدفع ضعف.
يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام إدراج ثقافة تحمل غشاء مسامي (فلتر) للحصول على كميات كبيرة من المواد محور عصبي النقي الذي هو مناسبة لالبيوكيميائية ويحلل immunocytochemical. استخدام مرشح إدراج لدراسة البيولوجيا تم تنفيذ محور عصبي أول مرة من قبل ستيوارد و4 الزملاء وتطويرها من قبل تويس وزملاؤه 5 إلى تكوينه الحالي. والتقنية هي الآن في الاستخدام الحالي من قبل الجماعات دراسة جوانب مختلفة من محور عصبي والتغصنات البيولوجيا، مع تعديلات طفيفة في كل حالة لاستيعاب السكان من الخلايا العصبية التي تمت دراستها، وإجراء العلاجات نوع من التحليلات الكيميائية الحيوية المستخدمة 6-9. هذا البروتوكول لا تنوي استيعاب جميع البدائل لمثل هذه مجموعة متنوعة من التطبيقات، وإنما يقدم مقاربة بسيطة التي هي مناسبة لمعظم التطبيقات. على وجه الخصوص، وبروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الطلاء الثلاثي الذي يزيد العائد للمحور عصبي التحليلات البيوكيميائية و هو الأكثر مناسبة لدراسة محور عصبي الطلاء، تنكس الأخرى الموصوفة في الأدبيات تنتج أقل المحاور التي تتراجع وتتدهور بشكل أسرع عند المحرومين من العوامل الغذائية 9.
في هذا الإجراء، لا تزال أجسام الخلايا العصبية معزولة فوق ملحق مرشحالمحاور إيل تمر من خلال المسام وتنمو على طول سطحه السفلي. المحاور النقي (خالية من الملوثات الدبقية والخلايا العصبية خلايا الجسم) التي تنمو على السطح السفلي للمرشح يمكن جمعها عن التحليلات الكيميائية الحيوية أو يمكن ان تكون ثابتة في الموقع وفحصها بواسطة تقنيات immunocytochemical 9. يعتمد الإجراء على استخدام الخلايا العصبية الحسية الجنينية من العقد الجذرية الظهرية (DRG). وتستخدم على نطاق واسع DRGs الجنينية لدراسة البيولوجيا محور عصبي بسبب neurites التي من هذه الخلايا تخضع لنمو سريع وقوي في المختبر عند الاحتفاظ بها في عامل نمو الأعصاب (NGF)، وبسبب أنها تخضع بسرعة انحطاط عندما يحرم من هذا العامل. أيضا، الخلايا العصبية DRG تفتقر التشعبات، حتى يتسنى لجميع neurites التي تم جمعها بواسطة هذه الطريقة هي محاور عصبية بحتة.
تمثل مرشح إدراج ميزة كبيرة بالمقارنة مع المناهج الأخرى المستخدمة لدراسة محاور عصبية. الدراسات التي تعتمد على استخدام المجهر لتمييز العمليات التي تحدث في الخلية سوما من تلك الموجودة فيتوفير المعلومات xons البيوكيميائية محدودة. وكمثال آخر، ونظم الثقافة مجزأة (على سبيل المثال، غرف Campenot 10 أو الأجهزة ميكروفلويديك 11) مفيدة لنهج التصوير والمعاملة التفضيلية للمقصورات الخلية ولكن لا توفر سوى كميات صغيرة من المواد محور عصبي، مما يحول دون استخدام هذه التقنيات لتحليل الكيمياء الحيوية والتي تتطلب كميات كبيرة نسبيا من العينة. علاوة على ذلك، استخدامها يتطلب تدريبا كبيرا وكذلك الأجهزة المتخصصة، وأنها مضيعة للوقت. مقاربة أخرى غالبا ما تستخدم لعزل المحاور من إإكسبلنتس هو إزالة مركز ازدراع (التي تحتوي على أجسام الخلايا العصبية) يدويا قبل جمع العينات محور عصبي. على الرغم من أن هذا يمكن أن تنتج كميات كبيرة من المستحضرات التخصيب المحور، محاور في هذا المستحضر يمكن يلفها الدبقية وإزالة بسرعة الهيئات 20 ازدراع وعلى التوالي في الفترة من 6 آبار (كمثال على تجربة الحد الأدنى) هو مضيعة للوقت وعلى الحد من جدوى.
في المقابل، فإن الطريقة المعروضة هنا تنتج الاستعدادات محور عصبي وفيرة والنقية التي يمكن بعد ذلك يتم تحليلها من قبل تقريبا أي أسلوب البيوكيميائية التي يشيع استخدامها لتحليل لست] خلية كاملة، مثل لطخة غربية، 6 مناعي، لطخة الشمالية 5 6 مطياف الكتلة، وتنقية الحمض النووي الريبي 7،12،13، من بين آخرين. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول يمكن تطبيقها على التألق المناعي (IF) التقنيات، كما أنه من الممكن لإصلاح المحاور نموا في الجانب السفلي من مرشح لمزيد من دراستها من قبل IF. هذا النهج يسهل كثيرا من عمليات تحليل محور عصبي محددة حيث لا توجد أجسام الخلايا في الإعداد النهائي. هذا هو ميزة كبيرة منذ إشارة مناعي عالية من أجسام الخلايا غالبا ما يقوض فحص وتحليل إشارة أضعف منشؤها من الهياكل رقيقة مثل محاور عصبية.
تطبيقين من الأسلوب الثقافة لدراسة محور عصبي تنكس عه وصفها؛ نموذج للتشذيب التنموية ونموذجا للانحطاط الناجم عن الإصابة (يشار إلى انحطاط ولري ع). ويستند نمذجة تشذيب التنموية على حقيقة أن الخلايا العصبية الحسية في الجسم الحي المنافسة للحد من كميات المشتقة من الهدف NGF وتلك فشله في الحصول على دعم كاف عصبية المنحطة 14. يمكن تحاكي هذه الظاهرة في الثقافات DRG الجنينية من خلال سحب NGF من وسائل الإعلام والثقافة، والتي، كما يحدث في الجسم الحي، يبدأ تنكس محور عصبي تليها تدمير خلايا الجسم. لنموذج الضمور ولري، يتم كشط الجانب العلوي من التصفية مع الهيئات الخلية بعيدا. المحاور التي نمت على الجانب السفلي من مرشح انفصلوا جسديا من أجسام الخلايا والخضوع بعد ذلك عملية التنكسية السريع والنمطية المعروفة باسم ولري الضمور 15، سميت A. الر الذين ذكرت أول هذه الظاهرة في عام 1850 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشمل المعلمات المهم أن تأخذ في الاعتبار عند التكيف مع هذه التقنية السكان العصبية التي سيتم دراستها، الركيزة، حجم المسام من مرشح ومساحة السطح. وجميع هذه المعلمات يؤثر على خصوصية ونوعية وكمية من إعداد محوار تم الحصول عليها، ويجب أن تدرس بعناية من قبل المستخدم النهائ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
