Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter

Summary

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Abstract

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Introduction

Die axonalen Kompartiment von Neuronen zeigt ein hohes Maß an funktionaler Unabhängigkeit von der somato-dendritischen Fach. In Projektionsneuronen, enthalten die meisten Axone der neuronalen Protein ^1,2. Das Studium der Physiologie und Pathophysiologie von Axonen hat Schwung in den Neurowissenschaften gewonnen, weil neuere Studien haben gezeigt, dass die frühe axonalen Dysfunktion scheint ein gemeinsames Merkmal der neurodegenerativen Erkrankungen und neuropsychiatrischen Störungen ³ sein. Es scheint wahrscheinlich, dass ein besseres Verständnis der axonalen-exklusive Mechanismen unter normalen und pathologischen Bedingungen wird Licht auf die frühen Ereignisse, die Dysfunktion fahren zu vergießen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie Kultureinsätze verwenden, die mit einem porösen Membran (Filter), um große Mengen von reinem axonalen Material, das geeignet ist für die biochemische und immunzytochemische Analysen zu erhalten. Der Einsatz von Filtereinsätze zu studieren axonalen Biologie wurde zuerst von Steward umgesetzt undKollegen ⁴ und weiter durch Twiss und Kollegen ^fünf seiner derzeitigen Konfiguration entwickelt. Die Technik ist jetzt in der aktuellen Nutzung durch Gruppen studieren verschiedene Aspekte der axonalen Dendriten und Biologie, mit leichten Modifikationen in jedem Fall für die Population von Neuronen untersucht zubringen, die durchgeführten Behandlungen und die Art der biochemischen Analysen ^6-9. Das vorliegende Protokoll hat nicht die Absicht, alle Alternativen für eine solche Vielzahl von Anwendungen unterzubringen, sondern eine einfache Methode, die für die meisten Anwendungen geeignet ist. Insbesondere die hier beschriebenen Protokoll verwendet eine Dreifach-Beschichtung, die axonalen Ausbeute für biochemische Analysen maximiert und ist bestens geeignet, um in der Literatur beschrieben axonalen Degeneration-anderen Beschichtungen studieren produziert weniger Axone, zurückziehen und schneller degenerieren, wenn sie von Nahrungsfaktoren ⁹ beraubt.

Bei diesem Verfahren bleiben die neuronale Zellkörper oberhalb der Filter wh isoliertile Axone verlaufen durch die Poren und wachsen entlang der Bodenoberfläche. Reine Axone (ohne Glia und neuronale Zellkörper Verunreinigungen), die auf der unteren Oberfläche des Filter wachsen kann für biochemische Analysen gesammelt werden oder kann in situ fixiert und durch immunzytochemische Methoden ⁹ untersucht werden. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von embryonalen sensorischen Neuronen der dorsalen Wurzelganglien (DRG). Embryonale DRGs sind weit verbreitet, um Biologie zu studieren, weil axonalen Neuriten aus diesen Zellen eine schnelle und robuste Wachstum in vitro, wenn sie in den Nervenwachstumsfaktor (NGF) gehalten, und weil sie schnell unterziehen Degeneration, wenn dieses Faktors beraubt. Auch DRG-Neuronen fehlt Dendriten, so dass alle mit dieser Methode gesammelt Neuriten sind rein Axone.

Filtereinsätze stellen im Vergleich zu anderen Ansätzen verwendet, um Axone zu studieren einen großen Vorteil. Untersuchungen sich auf die Verwendung der Mikroskopie zu unterscheiden Prozesse in der Zelle Soma von den in a vorkommendenXON-Fluß einen begrenzten biochemische Information. Als weiteres Beispiel teilten Kultursysteme (zB Campenot Kammern ¹⁰ oder ¹¹ Mikrofluidvorrichtungen) sind nützlich zur Bildgebung Ansätze und für eine unterschiedliche Behandlung von Zellkompartimenten, bieten aber nur geringe Mengen des axonalen Material, was die Verwendung dieser Techniken für biochemische Analysen, die erfordern, relativ große Probenmengen. Weitere, ihre Verwendung erfordert eine umfassende Ausbildung sowie spezielle Geräte, und sie zeitaufwendig sind. Ein weiterer Ansatz oft verwendet, um Axone aus Explantaten isolieren ist es, eine Explantation Zentrum (mit neuronalen Zellkörpern), bevor axonalen Probensammlung manuell entfernen. Dies kann zwar große Mengen von Axon-angereicherten Präparationen erzeugen können Axone in dieser Zubereitung in Glia umhüllt und schnell nacheinander Entfernen Körper 20 Explantat von 6 Vertiefungen (als Beispiel eines minimalen Experiment) ist zeitaufwendig und an der Grenze des Machbaren.

Im Gegensatz dazu ist die hier vorgestellte Methode liefert reichlich und rein axonalen Vorbereitungen, die dann von nahezu jedem biochemischen Technik, die häufig verwendet wird, um ganze-Zelllysaten analysieren, wie Western-Blot, Immunpräzipitation ^6, Northern ^{Blot-5-Massenspektrometrie 6,} RNA-Reinigung analysiert werden können ^7,12,13, unter anderem. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um (IF)-Techniken Immunfluoreszenz, wie es möglich ist, Axone wachsen in der unteren Seite des Filters weiter zu untersuchen, indem sie IF fixieren. Dieser Ansatz erleichtert die Analyse der axonalen spezifische Prozesse, da es keine Zellkörper in der letzten Vorbereitung. Dies ist ein bedeutender Vorteil, da eine hohe Immunfluoreszenzsignal vom Zellkörper oft untergräbt Prüfung und Analyse von einem schwächeren Signal von dünnen Strukturen wie Axone stammen.

Zwei Anwendungen der Methode zur Kultur axonalen Degeneration ar studierene beschrieben; ein Modell der Entwicklungs Beschneiden und Modell Verletzungs-induzierte Degeneration (gemeinhin als Waller-Degeneration bezeichnet). Die Modellierung der Entwicklungs Beschneiden basiert auf der Tatsache, daß sensorische Neuronen in vivo für limitierende Mengen an Ziel-abgeleitete NGF und diejenigen weil es nicht genug neurotrophen Unterstützung degenerierten ¹⁴ empfangen Wettbewerb basiert. Dieses Phänomen kann in embryonalen DRG-Kulturen durch Abziehen von NGF aus den Kulturmedien, die, wie es in vivo auslöst axonale Degeneration, gefolgt von Zellkörper Zerstörung nachgeahmt werden. Waller-Degeneration zu modellieren, wird die obere Seite des Filters mit den Zellkörpern abgeschabt. Die Axone, die auf der Unterseite des Filters werden physikalisch von den Zellkörpern getrennt und danach die schnelle und stereotype degenerativen Prozess wie Waller-Degeneration ¹⁵ bekannt ist, nach A. Waller genannt, der als erster das Phänomen berichtet, im Jahr 1850 ¹⁶ ziehen gewachsen.

Protocol

HINWEIS: Die folgenden Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council von Animal Care genehmigt. Alle Anstrengungen gemacht werden, um Schmerzen und Leiden der Tiere während der Verfahren zu minimieren. 1. Beschichtung der Filter HINWEIS: Wenn Kultur Filtereinsätze in Vertiefungen der Multiwellplatten gelegt werden zwei Kammern definiert: die obere Kammer ist der Bereich oberhalb des Einsatzes und die untere Kammer ist der unterhalb d…

Representative Results

Dorsalwurzelganglion Explantate von E13.5 Maus wachsen weitgehend auf Filter nacheinander beschichtet mit Poly-D-Lysin, Laminin und Kollagen (1B, links), von bis zu 2 mm innerhalb von 2 Tagen in Kultur. Dieses Substrat Kombination ergibt besonders üppige Wachstum; andere Kombinationen ergeben Axone, die wesentlich kürzer sind (Abbildung 1B, rechts). Darüber hinaus DRGs auf Filtern beibehalten erweitern mehr und mehr als Axone DRGs auf Kunststoff 1C gewachsen. <p …

Discussion

Wichtige Parameter, die bei der Anpassung dieser Technik nehmen sind die neuronalen Population, die untersucht werden sollen, ist das Substrat, Porengröße des Filters und Fläche. Alle diese Parameter beeinflussen die Spezifität, die Qualität und Quantität der Neuriten Zubereitung erhalten, und müssen durch den Anwender betrachtet werden. In den in diesem Protokoll angegebenen Beispiele die Verwendung von DRG-Neuronen hat den Vorteil, der sich nur Axone, wodurch ein reines (spezifischen) axonalen Zubereitung.

…

Materials

CD-1 mouse, E13 timed pregnancy	Charles River		In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)
Falcon Cell Culture Inserts	Corning	353102	1 µm pore size, fits 6-well receiving plate
Falcon Cell Culture Companion Plates	Corning	353502	Receiving plates for inserts
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P6407	Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C
PureCol Bovine Collagen Solution	Advanced Biomatrix	5005-B
Leibovitz's L-15 Medium	Invitrogen	11415-064	Can be replaced by DMEM.
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
B-27 Serum-Free Supplement	Invitrogen	17504-044
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU)	Sigma-Aldrich	F0503
NGF (2.5S, beta subunit)	Cedarlane	CLMCNET-001
Anti-NGF Antibody	Prepared in-house	–	As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)
	Alomone Labs	AN-240	Commercial option
Anti-Tubulin Antibody	Millipore	MAB5564
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody	Invitrogen	A-11029
DRG culture medium
Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)
1X Laemmli Sample Buffer
10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue