Получение и выделение Аксоны от сенсорных нейронов для биохимического анализа, используя пористые фильтры
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
Аксонов отсек нейронов показывает большую степень функциональной независимости от сомато-дендритных отсека. В проекционных нейронов, аксоны содержат большую часть нейронов 1,2 белка. Изучение физиологии и патофизиологии аксонов набрало обороты в неврологии сообщества, потому что недавние исследования показали, что раннее аксонов дисфункция, кажется, общая черта нейродегенеративных заболеваний и нервно-психических расстройств 3. Вполне вероятно, что лучшее понимание аксонов эксклюзивные механизмов при нормальных и патологических условиях прольет свет на ранних событий, которые ведут дисфункции.
Настоящий протокол описывает, как использовать культуру вставки подшипника пористую мембрану (фильтр), чтобы получить большие количества чистого аксонов материала, который подходит для биохимических и иммуноцитохимическая анализирует. Использование фильтра вставляет учиться аксонов биология была впервые реализована на Стюард иколлеги 4 и далее, разработанные Twiss и коллег 5 к ее нынешней конфигурации. Техника находится сейчас в текущей использования групп, изучающих различные аспекты аксонов и дендритов биологии, с небольшими изменениями в каждом конкретном случае для размещения для населения нейронов исследованных, лечение, выполняемые и тип биохимических анализов используется 6-9. Настоящий Протокол не намерен разместить всех альтернатив для такого разнообразия приложений, а скорее обеспечить простой подход, который подходит для большинства приложений. В частности, протокол, описанный здесь использует тройную покрытие, которое максимизирует аксонов выход для биохимических анализов и наиболее подходит для изучения дегенерация аксонов-другой покрытий, описанных в литературе производится меньше аксоны, что убираться и вырождающиеся быстрее, когда лишены трофических факторов 9.
В этой процедуре, нейронные органы клеток остаются изолированными на вершине Wh фильтровИль аксоны проходят через поры и расти вдоль его нижней поверхности. Чистые аксоны (свободные глии и нейронов загрязнений тела клетки), которые растут на нижней поверхности фильтра могут быть собраны для биохимических анализов или могут быть зафиксированы на месте и рассмотрены иммуноцитохимических методов 9. Процедура основана на использовании эмбриональных сенсорных нейронов из спинного ганглиев (DRG). Эмбриональные DRGs широко используются для изучения аксонов биологии, потому что нейритов из этих клеток претерпевают быстрый и устойчивый рост в пробирке, когда поддерживается в фактор роста нервов (NGF), а потому что они быстро дегенерируют когда лишены этого фактора. Кроме того, DRG нейроны не имеют дендриты, так что все невриты, собранные с помощью этого метода являются чисто аксоны.
Фильтровать вставки представляют большое преимущество по сравнению с другими подходами, используемыми для изучения аксоны. Исследования, основанные на принципе использования микроскопии дифференцировать процессы, происходящие в клетке сомы из тех, кто вXons обеспечивают ограниченную биохимический информацию. В качестве другого примера, узконаправленных систем культуры (например, Campenot камеры 10 или микрожидкостных устройств 11) полезны для подходов изображений и дифференцированного режима клеточных отсеках, но обеспечивают лишь небольшое количество аксонов материала, исключая применение этих методов для биохимических анализов, которые требуют относительно большие количества образца. Кроме того, их использование требует значительной подготовки, а также специализированные устройства, и они занимают много времени. Другой подход часто используется для изоляции аксонов от эксплантов является вручную удалить эксплантате центр (содержащий нейронные тела клетки) перед аксонов сбора проб. Хотя это может производить большое количество аксонов обогащенный препаратов, аксоны в этом препарате может быть, завернутые в глии и быстрого удаления тела 20 эксплантатов в последовательно от 6 скважин (в качестве примера минимального эксперимента) занимает много времени и на пределе возможности.
В противоположность этому, метод, представленный здесь производит обильные и чистые аксонов препараты, которые затем могут быть проанализированы с помощью практически любого биохимический метод, который обычно используется для анализа цельной клеточных лизатов, как вестерн-блоттинга, иммунопреципитации 6, Нозерн-блот-5 масс-спектрометрии 6, очистки РНК 7,12,13, среди других. Кроме того, протокол может быть применен к иммунофлюоресценции техники (If), как можно исправить аксоны, растущие в нижней стороне фильтра для дальнейшего изучения их IF. Такой подход значительно облегчает анализ аксонов конкретных процессов, так как нет клеточных тел в окончательной подготовки. Это значительное преимущество, так как высокая иммунофлуоресцентный сигнал от клеточных тел часто подрывает обследование и анализ более слабым сигналом, происходящих из тонких структур, таких как аксонов.
Два приложения метода культуры для изучения дегенерация аксонов арэ описано; модель обрезки развития и модели травмы-индуцированной дегенерации (обычно называют валлеровский дегенерации). Моделирование обрезки развития основана на том, что сенсорные нейроны в естественных условиях конкурировать для ограничения количества целевой полученных NGF и те не в состоянии получать достаточно нейротрофический поддержки вырожденный 14. Это явление можно имитировать в эмбриональных культурах DRG путем удаления NGF из культуральной среды, которая, как это происходит в естественных условиях, инициирует дегенерацию аксонов с последующим разрушением клеток тела. Для моделирования валлеровский дегенерации, верхняя сторона фильтра с клеточных тел разгреб. Аксоны, выросшие на нижней стороне фильтра стать физически отделен от клеточных тел и после этого пройти быструю и стереотипное дегенеративный процесс, известный как валлеровский дегенерации 15, имени А. Waller, которые впервые сообщили явление в 1850 году 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важные параметры, которые следует учитывать при адаптации этой техники включают нейронов населения, которые будут изучены, субстрат, размер пор фильтра и площадь поверхности. Все эти параметры будут влиять на специфичность, качество и количество аксонов препарата, полученного, и, долж…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
