Biyokimyasal Analiz için Duyu Nöronlar gelen üretim ve Aksonlar izolasyonu gözenekli Filtre Kullanma
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
Nöronların aksonal bölmesi somato-dendritik bölmesinden fonksiyonel bağımsızlık büyük derecesini gösterir. Projeksiyon nöronlarının olarak, aksonlar nöronal protein 1,2 çoğunu içerir. Son çalışmalar erken aksonal disfonksiyon nörodejeneratif hastalıklar ve nöropsikiyatrik bozuklukların 3 ortak bir özelliği olarak görünür olduğunu göstermiştir çünkü akson fizyolojisi ve fizyopatolojisi çalışma nörobilim toplumda ivme kazanmıştır. Bu normal ve patolojik koşullar altında akson-özel mekanizmaların daha iyi anlaşılması disfonksiyonu sürücü erken olaylara ışık tutacak gibi görünmektedir.
Mevcut protokol biyokimyasal için uygundur ve immünositokimyasal analizleri saf aksonal büyük miktarda malzeme elde etmek için gözenekli bir membran (filtre) taşıyan kültür ekler nasıl kullanılacağı açıklanır. Filtrenin kullanılması aksonal biyoloji ilk Steward tarafından yürütülen çalışma ekler veayrıca bugünkü yapılandırmasına Twiss ve arkadaşları 5 tarafından geliştirilen meslektaşları 4. ve. Bu teknik çalışılan nöronların nüfus için karşılamak için her durumda hafif modifikasyonlarla, akson ve dentrit biyoloji farklı yönlerini grup ile mevcut anda kullanımda, yapılan tedaviler ve biyokimyasal analizler type 6-9 kullanılır. Bu protokol uygulamaları gibi çeşitli tüm alternatifleri karşılamak niyetinde değil, bir çok uygulama için uygun olan basit bir yaklaşım sağlamaz. Özellikle, burada açıklanan protokol geri ve trofik faktörlerin 9 yoksun zaman daha hızlı dejenere az aksonlarını üretilen biyokimyasal analizler için aksonal verim maksimize ve literatürde tarif aksonal dejenerasyon-diğer kaplamalar incelemek için en uygun olan bir üçlü kaplama kullanır.
Bu prosedürde, nöronal hücre gövdeleri filtre wh üstünde izole edilmiş durumdaIle aksonlar gözeneklerinden geçmek ve taban yüzeyi boyunca büyür. Filtrenin alt yüzeyi üzerinde büyür (glia ve nöronal hücre gövdesi yabancı maddelerden arındırılmış) Saf akson biyokimyasal analizler için toplanabilir ya da in situ sabit ve imünositokimyasal teknikler 9 ile incelenebilir. Prosedür, arka kök gangliyon (DRG) embriyonik duyu nöronlarının kullanımına dayanır. Bu faktörün yoksun zaman hızlı bir şekilde geçmesi için dejenerasyon Embriyonik DRG'ler yaygın olarak sinir büyüme faktörü (NGF) tutulan zaman, bu hücrelerden nevritlerin in vitro olarak hızlı ve sağlam bir büyüme geçmesi için aksonal biyoloji incelemek için kullanılır ve. Bu yöntem ile toplanan tüm neurites saf aksonlar, böylece de, DRG nöronları, dendrit yoksundur.
Filtre uçlar aksonlarını incelemek için kullanılan diğer yöntemlere göre büyük bir avantaj oluşturmaktadır. Süreçleri olanlardan hücre soma meydana ayırt etmek için mikroskobu kullanımına dayanan çalışmalarXons sınırlı biyokimyasal bilgi sağlar. Başka bir örnek olarak, bölmeli kültür sistemleri (örneğin, 10 ya da Campenot odaları mikroakışkan cihazları 11) görüntüleme yaklaşımlara ve hücre bölmelerine ayırıcı tedavisi için yararlı olan, ancak gerekli biyokimyasal analizler için bu tekniklerin kullanımı engelleyen, aksonal malzemenin sadece küçük miktarlarda sağlamak numunenin, nispeten büyük miktarlarda. Dahası, bunların kullanımı önemli eğitim gibi özel cihazlar gerektirir ve zaman alıcı vardır. Genellikle Eksplantlardan aksonlarını izole etmek için kullanılan başka bir yaklaşım elle akson numune toplama önce (nöronal hücre gövdeleri içeren) bir eksplant merkezi kaldırmaktır. Bu akson zenginleştirilmiş preparatlar büyük miktarlarda üretmek de, bu hazırlanmasında aksonlar glia saran ve hızlı bir şekilde (en az bir deneyin bir örneği olarak) 6 kuyu art arda 20 eksplant bedenlerini çıkarılması olabilir, zaman alıcı ve fizibilite limitte.
Buna karşılık olarak, burada sunulan yöntem daha sonra western blot, immünopresipitasyon 6, kuzey blot 5 kütle spektrometrisi 6, RNA saflaştırma gibi sık bütün hücre lizatları analiz etmek için kullanılan hemen hemen her türlü biyokimyasal tekniği ile analiz edilebilir ve bol saf aksonal preparatlar üretir 7,12,13, ve diğerleri. Protokol, daha da IF ile incelemeye filtrenin alt tarafına büyüyen aksonlar düzeltmek için mümkün olduğu gibi, (IF) teknikleri bağışıklık uygulanabilir. Hiçbir hücre gövdeleri son hazırlık var çünkü bu yaklaşım büyük ölçüde aksonal özgü süreçlerin analizini kolaylaştırır. Hücre gövdeleri yüksek immunofluorescent sinyal çoğu muayene ve bu akson gibi ince yapılarından kaynaklanan bir zayıf sinyal analizi çürüten bu yana bu önemli bir avantajdır.
Aksonal dejenerasyon ar çalışma kültürü yöntemiyle İki uygulamalarıe tarif; gelişim budama ve yaralanma kaynaklı dejenerasyon modeli bir modeli (genel olarak Wallerian dejenerasyon anılacaktır). Gelişimsel budama modelleme in vivo duyusal nöronlar hedef türetilen NGF miktarlarda ve yeterli nörotrofık destek dejenere 14 almak için başarısız olan sınırlayıcı için rekabet olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Bu durum, in vivo olduğu gibi, vücut hücre yıkımı, ardından aksonal dejenerasyon başlatır, kültür ortamı, ikinci NGF çekilmesi ile DRG embriyonik kültürlerde taklit edilebilir. Wallerian dejenerasyona modellemek için, hücre gövdeleri ile filtrenin üst tarafı kazınarak. Fiziksel hücre gövdelerinden ayrıldı ve daha sonra, ilk olarak 1850 yılında 16 olgusunu bilgi A. Waller almıştır Wallerian dejenerasyon 15 olarak bilinen, hızlı ve stereotipik dejeneratif süreci, tabi olmak filtrenin alt tarafına büyümüştü aksonlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik uyarlama dikkate almak için önemli parametreler, incelenecek olan nöron popülasyonu, alt-tabakanın, filtrenin gözenek boyutu ve yüzey alanı bulunmaktadır. Tüm bu parametreler elde edilen nörit hazırlama özgüllüğü, kalite ve miktar etki edecek, ve son kullanıcı tarafından dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Bu protokolde yer alan örneklerde, DRG nöronlarının kullanımı, böylece, saf (özel) aksonal hazırlama vermek için sadece aksonlar uzanan avantajına sahiptir.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
