생화학 적 분석에 대한 감각 뉴런에서 생산 및 축삭의 분리는 다공성 필터를 사용하여
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
신경 세포의 축삭 구획 somato-돌기 실에서 기능적 독립의 큰 정도를 보여줍니다. 투사 뉴런의 축삭은 신경 세포의 단백질 1,2의 대부분을 포함하고 있습니다. 최근의 연구는 초기 축삭 장애는 신경 퇴행성 질환 및 신경 정신 장애 3의 공통적 인 특징이 나타납니다 것으로 나타났습니다 때문에 축삭의 생리와 병리 생리학의 연구 결과는 신경 과학 사회에서 힘을 얻고있다. 그것은 정상 및 병적 인 조건에서 축삭 독점 메커니즘에 대한 이해가 장애를 구동 초기 이벤트에 빛을 발산 할 것으로 보인다.
이 의정서는 생화학에 적합하며 면역 세포 화학 분석 순수 축삭 물질의 많은 양을 얻기 위해 다공성 막 (필터) 베어링 문화 삽입물을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 필터의 사용은 축삭 생물학 처음 스튜 워드에 의해 구현 된 공부를 삽입하고또한 현재의 구성에 Twiss의 동료 (5)에 의해 개발 된 동료 4. 기술은 연구 뉴런의 인구를 수용하는 각각의 경우에 약간의 수정과 함께, 축삭과 수상 돌기 생물학의 다양한 측면을 연구 그룹에 의해 현재 사용중인 지금, 수행먼트와 생화학 적 분석의 유형 6-9을 사용했다. 본 프로토콜은 응용 프로그램 같은 다양한 모든 대안을 수용 할 생각입니다 만, 오히려 대부분의 응용 프로그램에 적합한 간단한 방법을 제공하지 않습니다. 특히, 여기에서 설명하는 프로토콜은 철회 및 영양 요인 9 박탈 때 더 빨리 퇴화 적은 축삭을 생산 생화학 적 분석에 대한 축삭의 수율을 극대화하고, 문헌에 기술 된 축삭 변성 – 다른 코팅을 공부하기에 최적 인 트리플 코팅을 사용합니다.
이 과정에서 신경 세포 기관은 필터 WH 꼭대기에 고립 된 상태로 유지일의 축색 돌기가 모공을 통과 및 바닥면을 따라 성장한다. 필터의 저면에 성장 (아교 및 신경 세포체 오염물) 순수한 축삭 생화학 분석을 위해 수집하거나 반응계에서 고정 및 면역 세포 화학 기법 (9)에 의해 조사 될 수있다. 절차는 후근 신경절 (DRG)에서 배아 감각 뉴런의 사용에 의존한다. 이 요인을 박탈 때 빠르게 퇴보를 받아야하기 때문에 배아 개의 DRG 널리 신경 성장 인자 (NGF)에 유지하면 이들 세포에서 신경 돌기는 체외에서 빠르고 강력한 성장을 받아야하기 때문에 축삭 생물학을 연구하는 데 사용하고있다. 이 방법에 의해 수집 된 모든 신경 돌기가 순수 축삭 수 있도록 또한, DRG의 신경 세포는 수상 돌기 부족합니다.
필터 삽입은 축삭을 연구하는 데 다른 방법에 비해 큰 이점을 나타냅니다. 프로세스 에서와는 셀 소마에서 발생 차별화 현미경의 사용에 의존 연구xons 제한 생화학 적 정보를 제공합니다. 다른 예로서, 구획화 배양 시스템 (예 Campenot 챔버 (10) 또는 미세 유동 장치 (11))은 촬상 방법 및 세포 구획 차동 치료에 유용하지만 필요 생화학 적 분석에 대한 이러한 기술의 사용을 배제, 축삭 물질의 소량 만 제공 샘플의 비교적 다량. 또한, 자신의 사용은 중요한 교육뿐만 아니라 전문 장비를 필요로하고, 그들은 시간이 소요됩니다. 종종 이식편에서 축삭을 분리하는 데 사용하는 또 다른 방법은 수동 축삭 시료 채취 전에 (신경 세포의 세포체 함유) 이식편 센터를 제거하는 것이다. 이 축삭 농축 제제의 대량 생산 할 수 있지만,이 준비 축삭이 아교에 싸여 빠르게 (최소 실험의 예를 들어) 6 우물에서 연속 20 이식편의 몸을 제거 할 수있는 시간이 오래 걸릴하고 가능성의 한계에.
대조적으로, 여기에 제시된 방법은 서양 얼룩, 면역 6, 북부 오점 5 질량 분석 6, RNA 정화와 같은 일반적으로 전체 세포 용 해물을 분석하는 데 사용되는 거의 모든 생화학 적 기법에 의해 분석 될 수있다 풍부하고 순수 축삭 준비를 생산 7,12,13, 다른 사람의 사이에서. 또한, 프로토콜은 상기 IF에서이를 검사하는 필터의 바닥 측에서 성장하는 축삭을 고정 할 수있는 한, (IF)를 면역 형광 기법에 적용될 수있다. 제공된 세포체는 최종 준비가 없기 때문에이 접근법은 크게 축삭 특정 프로세스의 분석을 용이하게한다. 세포 기관에서 높은 면역 신호가 자주 검사와 같은 축삭 얇은 구조에서 발생하는 약한 신호의 분석을 저해하기 때문에 이것은 큰 장점이다.
축삭 변성 AR을 연구하는 배양 방법의 두 가지 응용 프로그램전자 기술; 발달 전정 부상 유도 퇴화 모델의 모델 (통상 Wallerian 변성 함). 발달 전정의 모델링은 생체 내 감각 뉴런 타겟 유래 NGF의 양 및 충분한 신경성지지 축퇴 (14)를 수신하지 못하고 그 제한에 대해 경쟁한다는 사실에 근거한다. 이 현상은 생체 내에서 일어나는로서, 균체 파괴 다음에 축삭 변성을 시작, 배양 배지에서 NGF를 철수하여 배아 DRG의 문화에서 모방 할 수 있습니다. Wallerian 변성을 모델링하기 위해, 균체와 함께 필터의 상부 측이 긁어된다. 물리적으로 균체로부터 분리 한 후, 제 1850 16 현상을보고 A. 월러 따서 Wallerian 변성 (15)로서 알려진 신속하고 진부한 퇴행성 과정을 거칠되어 필터의 바닥 측 상에 성장한 축삭.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기술을 채택 할 때 고려해야 할 중요한 매개 변수는 공부한다 신경 세포의 인구, 기판, 필터의 기공 크기 및 표면 영역을 포함한다. 이러한 모든 파라미터가 얻어 신경 돌기 제제의 특이성, 질 및 양에 영향을 미칠 것이며, 최종 사용자에 의해 신중하게 고려되어야한다. 이 프로토콜에 제시된 예에서, DRG 신경 세포의 사용, 따라서 순수 (특정) 축삭 제제를주는 유일한 축삭 연장되는 이점이있다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
