जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए संवेदी न्यूरॉन्स से उत्पादन और axons की अलगाव खुली फिल्टर का प्रयोग
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
न्यूरॉन्स की axonal डिब्बे शारीरिक अथवा मानव शरीर संबंधी अर्थ में समास रूप वृक्ष के समान डिब्बे से कार्यात्मक स्वतंत्रता की एक बड़ी डिग्री से पता चलता है. प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में, axons neuronal प्रोटीन 1,2 के सबसे होते हैं. हाल के अध्ययनों से जल्दी axonal शिथिलता neurodegenerative रोगों और neuropsychiatric विकारों 3 की एक आम सुविधा प्रतीत होता है कि पता चला है क्योंकि axons की फिजियोलॉजी और pathophysiology के अध्ययन तंत्रिका विज्ञान समुदाय में रफ्तार पकड़ ली है. यह सामान्य और रोग की शर्तों के तहत axonal अनन्य तंत्र की एक बेहतर समझ शिथिलता ड्राइव कि प्रारंभिक घटनाओं पर प्रकाश डाला जाएगा कि संभावना लगती है.
वर्तमान प्रोटोकॉल जैव रासायनिक के लिए उपयुक्त है और immunocytochemical विश्लेषण करती है कि शुद्ध axonal सामग्री की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक झरझरा झिल्ली (फिल्टर) असर संस्कृति आवेषण का उपयोग कैसे करें. फिल्टर का उपयोग axonal जीव विज्ञान प्रथम प्रबंधक द्वारा लागू किया गया था अध्ययन करने के लिए सम्मिलित करता है औरआगे अपने मौजूदा विन्यास को Twiss और उनके सहयोगियों ने 5 द्वारा विकसित सहयोगियों 4 और. तकनीक का अध्ययन न्यूरॉन्स की आबादी के लिए समायोजित करने के लिए प्रत्येक मामले में मामूली संशोधनों के साथ, axonal और dendrite जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन समूहों द्वारा वर्तमान उपयोग में है, प्रदर्शन उपचार और जैव रासायनिक विश्लेषण के प्रकार 6-9 इस्तेमाल किया. वर्तमान प्रोटोकॉल आवेदनों की एक ऐसी किस्म के लिए सभी विकल्पों को समायोजित करने का इरादा है, बल्कि सबसे अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है कि एक साधारण दृष्टिकोण प्रदान नहीं करता है. विशेष रूप से, यहां वर्णित प्रोटोकॉल वापस लेना और पौष्टिकता संबंधी कारकों 9 से वंचित जब तेजी से पतित कि कम axons उत्पादित जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए axonal उपज अधिकतम और साहित्य में वर्णित axonal अध: पतन दूसरे कोटिंग्स अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त है कि एक ट्रिपल कोटिंग का उपयोग करता है.
इस प्रक्रिया में, neuronal सेल निकायों फिल्टर क ऊपर पृथक रहनाइले axons छिद्रों के माध्यम से गुजरती हैं और इसके नीचे की सतह के साथ बड़े होते हैं. फिल्टर के नीचे की सतह पर होते हैं कि (glia और neuronal सेल शरीर प्रदूषणों से मुक्त) शुद्ध axons जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है या बगल में तय की और immunocytochemical तकनीकों 9 द्वारा जांच की जा सकती है. प्रक्रिया पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) से भ्रूण संवेदी न्यूरॉन्स के उपयोग पर निर्भर करता है. इस पहलू से वंचित जब वे तेजी से अध: पतन से गुजरना क्योंकि भ्रूण DRGs व्यापक रूप से तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) में बनाए रखा जब इन कोशिकाओं से neurites विट्रो में तेजी से और मजबूत वृद्धि से गुजरना क्योंकि axonal जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और कर रहे हैं. इस विधि द्वारा एकत्रित सभी neurites विशुद्ध रूप से axons हैं इतना है कि इसके अलावा, DRG न्यूरॉन्स, डेन्ड्राइट की कमी है.
फ़िल्टर सम्मिलित करता axons का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों की तुलना में एक महान लाभ का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रक्रियाओं एक में उन से सेल सोमा में होने वाली अंतर करने माइक्रोस्कोपी के उपयोग पर निर्भर अध्ययनxons सीमित जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करते हैं. एक अन्य उदाहरण के रूप में बंटे संस्कृति प्रणालियों (जैसे, Campenot कक्षों 10 या microfluidic उपकरणों 11) इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए और सेल के डिब्बों के अंतर के इलाज के लिए उपयोगी होते हैं लेकिन आवश्यकता होती है जो जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इन तकनीकों का उपयोग precluding axonal सामग्री की ही छोटी मात्रा में उपलब्ध कराने नमूने की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में. इसके अलावा, उनके उपयोग महत्वपूर्ण प्रशिक्षण के साथ ही विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और वे समय लेने वाली हैं. अक्सर explants से axons अलग करने के लिए इस्तेमाल किया एक और दृष्टिकोण को मैन्युअल axonal नमूना संग्रह से पहले (neuronal सेल निकायों युक्त) एक explant केंद्र को दूर करने के लिए है. इस अक्षतंतु समृद्ध तैयारी की बड़ी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं, इस तैयारी में axons glia में छा और तेजी से (एक न्यूनतम प्रयोग का एक उदाहरण के रूप में) 6 कुओं से लगातार 20 explant के शव को हटाने जा सकता है समय लेने वाली है और व्यवहार्यता की सीमा पर.
इसके विपरीत, यहाँ प्रस्तुत विधि तो पश्चिमी धब्बा, immunoprecipitation 6, उत्तरी धब्बा 5 मास स्पेक्ट्रोमेट्री 6, शाही सेना शुद्धि जैसे आमतौर पर पूरे सेल lysates का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि लगभग किसी भी जैव रासायनिक तकनीक, द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है कि प्रचुर मात्रा में और शुद्ध axonal तैयारियों का उत्पादन 7,12,13, दूसरों के बीच में. इसके अलावा, प्रोटोकॉल इसे आगे तो उन्हें जांच के लिए फिल्टर के नीचे की ओर में बढ़ रही axons ठीक करने के लिए संभव है, के रूप में (यदि) तकनीक immunofluorescence के लिए लागू किया जा सकता है. कोई सेल शरीर अंतिम तैयारी में है क्योंकि वहाँ यह दृष्टिकोण बहुत axonal विशेष प्रक्रियाओं के विश्लेषण की सुविधा. सेल शरीर से एक उच्च Immunofluorescent संकेत अक्सर परीक्षा और ऐसे axons के रूप में पतली संरचनाओं से होने वाले एक कमजोर संकेत के विश्लेषण को नजरअंदाज बाद से यह एक महत्वपूर्ण लाभ है.
Axonal अध: पतन की गिरफ्तारी का अध्ययन करने के लिए संस्कृति विधि के दो आवेदनई वर्णित; विकास छंटाई और चोट प्रेरित अध: पतन का एक मॉडल की एक मॉडल (सामान्यतः के रूप में Wallerian अध: पतन के लिए कहा गया है). विकास छंटाई की मॉडलिंग vivo में संवेदी न्यूरॉन्स लक्ष्य प्राप्त NGF की मात्रा और पर्याप्त neurotrophic समर्थन पतित 14 प्राप्त करने में विफल रही उन सीमित करने के लिए प्रतिस्पर्धा है कि इस तथ्य पर आधारित है. इस घटना विवो में होता है, सेल शरीर के विनाश के द्वारा पीछा axonal अध: पतन की शुरुआत करता है, जो संस्कृति मीडिया से NGF वापस लेने के द्वारा भ्रूण डीआरजी संस्कृतियों में मजाक उड़ाया जा सकता है. Wallerian अध: पतन मॉडल के लिए, सेल शरीर के साथ फिल्टर के ऊपर की ओर दूर scraped है. शारीरिक रूप से सेल शरीर से अलग कर दिया और उसके बाद पहली बार 1850 16 में घटना की सूचना दी जो ए वालर के नाम पर रखा Wallerian अध: पतन 15 के रूप में जाना तेजी से और stereotypic अपक्षयी प्रक्रिया से गुजरना बन फिल्टर के नीचे की ओर पर हो गई थी कि axons.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तकनीक आदत डाल जब खाते में लेने के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों का अध्ययन किया जाएगा कि neuronal आबादी, सब्सट्रेट, फिल्टर के छेद के आकार और सतह क्षेत्र शामिल हैं. इन सभी मापदंडों प्राप्त neurite तैयारी की विशिष्टता, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
References
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