Produktion och isolering av Axoner från sensoriska neuroner för biokemisk analys med porösa filter

Summary

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Abstract

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Introduction

Den axonal fack av nervceller visar en hög grad av funktionellt oberoende från somato-dendritiska facket. I projektion nervceller, axoner innehåller de flesta av de neuronala protein ^1,2. Studiet av fysiologi och patofysiologi axoner har tagit fart i neurovetenskap samhället eftersom nyare studier har visat att tidig axonal dysfunktion verkar vara ett vanligt inslag i neurodegenerativa sjukdomar och neuropsykiatriska sjukdomar ^3. Det verkar troligt att en bättre förståelse av axonal-exklusiva mekanismer under normala och patologiska förhållanden kommer att belysa de tidiga händelser som driver dysfunktion.

Den nuvarande protokollet beskriver hur man använder kulturinsatser som bär ett poröst membran (filter) för att erhålla stora mängder ren axonal material som är lämpligt för biokemisk och immuncytokemiska analyser. Användningen av filterinsatser för att studera axonal biologi infördes först av Steward ochkollegor ⁴ och ytterligare utvecklats av Twiss och kollegor ⁵ till sin nuvarande konfiguration. Tekniken är nu i bruk av grupper som studerar olika aspekter av axonal och Dendrite biologi, med smärre ändringar i varje enskilt fall för att rymma för befolkningen i nervceller som studerats, de behandlingar som utförs och vilken typ av biokemiska analyser används ^6-9. Den nuvarande protokollet har inte för avsikt att rymma alla alternativ för så många olika applikationer, utan snarare ger en enkel metod som är lämplig för de flesta applikationer. Särskilt det protokoll som beskrivs här använder en trippel beläggning som maximerar axonal avkastning för biokemiska analyser och är lämpligast att studera axonal degeneration-andra beläggningar som beskrivs i litteraturen producerade mindre axoner som drar tillbaka och urarta snabbare när miste trofiska faktorer ^9.

I detta förfarande förblir neuronala cellkroppar isolerade ovanpå filter while axoner passera genom porerna och växa längs sin bottenyta. Rena axoner (gratis glia och neuronala cellkropps föroreningar) som växer på undersidan av filtret kan tas för biokemiska analyser eller kan fixeras på plats och granskas av immunocytokemiska tekniker ^9. Förfarandet förlitar sig på användningen av embryonala sensoriska neuroner från dorsala rotganglier (DRG). Embryonala DRG används ofta för att studera axonal biologi eftersom neuriter från dessa celler genomgår snabb och robust tillväxt in vitro då upprätthålls i nervtillväxtfaktorn (NGF), och eftersom de snabbt genomgår degeneration när de berövas denna faktor. Även DRG nervceller saknar dendriter, så att alla neuriter som samlas in av denna metod är rent axoner.

Filterinsatser utgör en stor fördel jämfört med andra metoder som används för att studera axoner. Studier som förlitar sig på användning av mikroskopi för att differentiera processer som förekommer i cellen soma från dem i enXON ger begränsad biokemisk information. Som ett annat exempel, compartmentalized kultursystem (t.ex. Campenot kammare ¹⁰ eller mikrofluidikanordningar ¹¹⁾ är användbara för avbildning och differentierad behandling av cellfack utan ger endast små mängder av axonal material, utgör hinder för att använda dessa tekniker för biokemiska analyser som kräver relativt stora mängder prov. Vidare kräver användningen betydande utbildning samt specialiserade enheter, och de är tidskrävande. En annan metod som ofta används för att isolera axoner från explants är att manuellt ta bort en Explantation center (innehåller neuronala cellkroppar) före axonal provsamling. Även om detta kan producera stora mängder axon-berikade preparat, kan axoner i denna beredning vara insvept i glia och snabbt avlägsna 20 Explantation kroppar i följd från 6 brunnar (som ett exempel på en minimal experiment) är tidskrävande och på gränsen till genomförbarhet.

Däremot den metod som presenteras här ger rikliga och rena axonal preparat som sedan kan analyseras av praktiskt taget alla biokemiska teknik som ofta används för att analysera hela cellysat, som western blot, immunprecipitering ^6, norra blot ⁵ masspektrometri ^6, RNA-rening ^7,12,13, bland andra. Dessutom kan protokollet tillämpas på immunofluorescens (IF)-tekniker, eftersom det är möjligt att fixera axoner som växer i den undre sidan av filtret för att ytterligare undersöka dem genom IF. Detta tillvägagångssätt underlättar i hög grad analysen av axonal specifika processer, eftersom det inte finns några cellkroppar i den slutliga beredningen. Detta är en betydande fördel eftersom en hög immunfluorescerande signal från cellkroppar gräver ofta undersökning och analys av en svagare signal som kommer från tunna strukturer såsom axoner.

Två tillämpningar av odlingsmetod för att studera axonal degeneration ARe beskrivits; en modell för utvecklings beskärning och en modell av skada-inducerad degeneration (vanligen kallad Wallerian degeneration). Modelleringen av utvecklings beskärning är baserad på det faktum att sensoriska neuroner in vivo konkurrera om begränsande mängder av mål-härlett NGF och de som misslyckas med att få tillräckligt med neurotrofisk stöd degenererad ^14. Detta fenomen kan efterliknas i embryonala DRG-kulturer genom att dra tillbaka NGF från odlingsmediet, vilket som inträffar in vivo, initieras axonal degenerering följt av cellkroppen förstörelse. För att modellera Wallerian degeneration, är den övre sidan av filtret med cellkropparna bortskrapad. De axoner som hade vuxit på undersidan av filtret blir fysiskt separerade från cellkroppar och därefter genomgå en snabb och stereotypa degenerativ process som kallas Wallerian degeneration ^15, uppkallad efter A. Waller som först rapporterade fenomenet 1850 ^16.

Protocol

OBS: Följande procedurer är i enlighet med riktlinjer som godkänts av den kanadensiska rådet om Animal Care. Alla ansträngningar görs för att minimera smärta och ångest av djur under förfarandena. 1. Beläggning av Filters ANMÄRKNING: När kulturen Filterinsatserna placeras i brunnarna av flerbrunnsplattor är två fack definieras: det översta facket är det område ovanför insatsen och bottenfacket är en nedanför insatsen Figur 1A.ab.</stron…

Representative Results

Dorsala ganglion explants från E13.5 möss växer mycket på filter belagda sekventiellt med poly-D-lysin, laminin och kollagen (Figur 1B, vänster) och når upp till 2 mm inom 2 dagar i odling. Detta substrat kombination ger särskilt översvallande tillväxt; andra kombinationer ger axoner som är betydligt kortare (Figur 1B, höger). Dessutom DRG underhålls på filter förlänga fler och längre axoner än DRG odlas på plast figur 1C. …

Discussion

Viktiga parametrar för att ta hänsyn till vid anpassning av denna teknik inkluderar den neuronala populationen som kommer att studeras, substratet, porstorleken hos filtret och ytarea. Alla dessa parametrar påverkar specificiteten, kvalitet och kvantitet av neurit preparatet erhållits, och måste övervägas noga av slutanvändaren. I de exempel som återges i detta protokoll, användning av DRG nervceller har fördelen att utvidga bara axoner, vilket ger en ren (specifik) axonal förberedelser.

<p class="jove_c…

Materials

CD-1 mouse, E13 timed pregnancy	Charles River		In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)
Falcon Cell Culture Inserts	Corning	353102	1 µm pore size, fits 6-well receiving plate
Falcon Cell Culture Companion Plates	Corning	353502	Receiving plates for inserts
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P6407	Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C
PureCol Bovine Collagen Solution	Advanced Biomatrix	5005-B
Leibovitz's L-15 Medium	Invitrogen	11415-064	Can be replaced by DMEM.
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
B-27 Serum-Free Supplement	Invitrogen	17504-044
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU)	Sigma-Aldrich	F0503
NGF (2.5S, beta subunit)	Cedarlane	CLMCNET-001
Anti-NGF Antibody	Prepared in-house	–	As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)
	Alomone Labs	AN-240	Commercial option
Anti-Tubulin Antibody	Millipore	MAB5564
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody	Invitrogen	A-11029
DRG culture medium
Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)
1X Laemmli Sample Buffer
10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue