В режиме реального времени изображений миелоидных клеток Dynamics в<em> Арс<sup> Мин / +</sup</em> Кишечная Опухоли на вращающемся диске конфокальной микроскопии
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
Миелоидных клеток являются наиболее распространенными иммунные клетки в опухоли и, как было показано, чтобы способствовать прогрессии опухоли. Современные методы визуализации прижизненные включить наблюдение за живой клеточной поведения внутри органа, но может быть сложным в некоторых видов рака за счет органов и опухоли доступности таких как кишечник. Прямое наблюдение кишечных опухолей ранее не сообщалось. Хирургическая процедура, описанная здесь позволяет прямое наблюдение динамики миелоидных клеток внутри кишечника опухоли в живых мышей с помощью трансгенных люминесцентные репортер мышей и инъекционные индикаторов или антитела. Для этого, четыре цвета, мульти-область, микро-линзами вращающийся диск конфокальной микроскопии, который позволяет долгосрочное непрерывное изображений с быстрым получения изображений был использован. APC мин / + мышей, которые развиваются несколько аденомы в тонком кишечнике пересекаются с C-FMS-EGFP мышей визуализировать миелоидных клеток и на мышах ACTB-ECFPвизуализировать кишечные эпителиальные клетки крипт. Процедуры маркировки различных компонентов опухоли, такие как кровеносные сосуды и нейтрофилов, и порядок расположения опухоли для получения изображений с помощью поверхности серозной оболочки, также описаны. Покадровой фильмы, собранные от нескольких часов визуализации позволяют анализировать миелоидной поведения клеток на месте в желудочно-кишечном микросреды.
Introduction
Подавляющее доказательства теперь показывает, что микроокружение опухоли, состоящей из гетерогенных клеточных популяций, в том числе фибробласты, эндотелиальные клетки, иммунных и воспалительных клеток, внеклеточный матрикс, и растворимых факторов, играет важную роль в инициации и прогрессировании солидных опухолей, способствуя почти все отличительными чертами рака 1. Действительно, во время прогрессирования опухоли, есть постоянные динамические взаимодействия между трансформированных раковых клеток и стромальных клеток, которые развиваются генерировать микросреду благоприятной для злокачественного 2. Среди иммунных клеток, которые проникают микросреды опухоли, миелоидных клеток являются наиболее распространенными 3. Состоит из ассоциированных с опухолью макрофагов (ТАМ), полученный из миелоидных клеток-супрессоров (MDSCs), дендритные клетки (DC) и нейтрофилов (ПМЯ), миелоидные клетки набраны из костного мозга и постепенно проникнуть опухоли, выпуская цитокинов, факторов роста и протеаз, которые может способствоватьрост опухоли и распространение 4. Перекрестные помехи между раковыми клетками и миелоидных клеток является сложной, но динамично. Таким образом, понимание природы их взаимодействия имеет решающее значение для определения, почему эти клетки способствуют прогрессии рака вместо участия в противоопухолевой иммунной реакции, и может помочь найти новые цели для контроля его.
Прямое наблюдение по прижизненной микроскопии предоставляет информацию о динамике клеточных в тканях живого мышей 5. Четыре цвета, мульти-область, микро-линзами вращающийся диск конфокальной система была разработана для изучения стромальных клеток в опухоли молочной железы 6. Такой подход позволяет долгосрочное непрерывное изображений и включает в себя ряд преимуществ, таких как (а) приобретение быстрые изображения, чтобы минимизировать артефакты движения, (б) долгосрочного анестезии, (с) четыре приобретение цвет следовать различные типы клеток, (г) люминесцентная маркировки из различных опухолевых компонентов, и (е) наблюдение различных опухолевых микросреды остроумияхин тот же мышь, чтобы избежать мышь к изменчивости мыши 7-9. С помощью этой технологии, различные типы поведения клеток были зарегистрированы в вируса опухоли молочной железы (MMTV) промоутер управляемой полиома среднего T онкоген (PyMT) модели, которая отображает прогрессивные этапы туморогенеза. Регуляторные Т-лимфоциты (Tregs, визуализированы трансгеном Foxp3 EGFP) мигрируют преимущественно в непосредственной близости от кровеносных сосудов, тогда как ДК (CD11c-DTR-EGFP), карциномы связано фибробластов (Fsp1 + / + -EGFP) и миелоидных клеток (C-FMS -EGFP) проявляют высокую подвижность на периферии опухоли, чем в опухолевой массы. В условиях острой системной гипоксии, клетки мигрировали по-разному: Tregs остановки миграции в отличие от миелоидных клеток, которые продолжают двигаться 6. Кроме того, в той же модели на мышах, было показано, что изменения чувствительности доксорубицин с стадии опухоли, распространение наркотиков связано с ответом наркотиков, и доксорубицинаобработка приводит к CCR2-зависимой найма миелоидных клеток к опухолям. Таким образом, живая изображений также может быть использован получить представление ответов наркотиков в месте и биологию химиорезистентности 10,11.
САП палочка (APC) генные мутации обычно возникают в аденом человека колоректального и рака 12 и мутации одной копии результатов генных APC в САП (ФАП), который придает чрезвычайно высокий риск развития рака толстой кишки 13. Штамм мыши Арс Мин / + несет усечения мутацию в кодоне 850 гена APC И спонтанно развивается несколько кишечные аденомы всему тонкой кишки 14 по 16. Долгосрочный прижизненной визуализации кишечника является сложной задачей, так как в инвазивности процедуры, с момента открытия в брюшную полость необходимо для доступа к кишечнике. Краткосрочная жить изображений улudies опубликованы ранее на здорового кишечника 17,18, но долгосрочное прямое наблюдение кишечных опухолей не сообщалось. Хирургическая процедура была разработана и уточнена визуализировать опухоли через серозной поверхности кишечника, с помощью прижизненной спиннинг системы диска микроскопии ранее использовался для изображения опухолей молочной железы 6,10. В этой статье, протокол описывается, что позволяет проследить поведение миелоидных клеток в опухоли в тонкой кишке с помощью APC мин / + мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье, подробный протокол описывается для прядения диска конфокальной микроскопии динамики миелоидных клеток в кишечных опухолей в течение нескольких часов в живого животного, изображение получено с серозной стороны кишечнике.
Чтобы избежать воспаления и име?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Ин ю для Apc Min / + мышей генотипирования. Работа выполнена при поддержке за счет средств INSERM и грантов (CA057621 и AI053194) из Национального института здоровья.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
