Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
Myeloide Zellen sind die am häufigsten vorkommenden Immunzellen in Tumoren und haben gezeigt, dass Tumorprogression zu fördern. Moderne bildgebende Verfahren ermöglichen Intravital die Beobachtung von lebenden Zellverhalten im Inneren der Orgel, sondern kann eine Herausforderung in einigen Arten von Krebs durch Orgel und Tumor Zugänglichkeit sein wie Darm. Die direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde bisher nicht berichtet worden. Eine hier beschriebene chirurgische Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung der myeloischen Zelldynamik in den Darmtumoren in lebenden Mäusen mit Hilfe transgener Mäuse fluoreszierenden Reporter und injizierbare Tracer oder Antikörper. Zu diesem Zweck wird ein Vier-Farben-, Multi-Region, Mikrolinsen-Spinning-Disk konfokalen Mikroskop, die langfristige, kontinuierliche Bildgebung mit schneller Bildaufnahme ermöglicht wurde verwendet. Apc Min / + Mäusen, die mehrere Adenome im Dünndarm zu entwickeln sind gekreuzt mit c-fms-EGFP Mäuse myeloischen Zellen visualisieren und mit ACTB-ECFP Mäuseauf intestinalen Epithelzellen der Krypten zu visualisieren. Verfahren zur Markierung von verschiedenen Tumorkomponenten, wie Blutgefäße und Neutrophilen, und das Verfahren zum Positionieren des Tumors für die Bildgebung durch die Serosa-Oberfläche werden ebenfalls beschrieben. Zeitraffer-Filme von mehreren Stunden von bildgebenden zusammengestellt ermöglichen die Analyse von myeloischen Zellverhalten in situ in der Darmmikroumgebung.
Introduction
Überwältigenden Beweis zeigt nun, daß der Tumor-Mikroumgebung, die aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Immun-und Entzündungszellen, extrazelluläre Matrix und lösliche Faktoren spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung und Progression von soliden Tumoren, indem sie zu fast Kennzeichen von Krebs 1. Tatsächlich, während der Tumorprogression gibt es konstante dynamische Wechselwirkungen zwischen transformierten Krebszellen und Stromazellen, die eine Mikro günstig Malignität 2 erzeugen entwickeln. Zu den Immunzellen, die das Tumor-Mikroumgebung zu infiltrieren sind myeloischen Zellen die am häufigsten vorkommende 3. Bestehend aus Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), dendritische Zellen (DC) und Neutrophilen (PMN), werden Knochenmarkzellen aus Knochenmark gewonnen und fortschreitend zu infiltrieren Tumoren, Freisetzung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Proteasen, fördern könnenTumorwachstum und zu verbreiten 4. Das Übersprechen zwischen den Krebszellen und myeloischen Zellen ist komplex, sondern dynamisch. Somit ist das Verständnis der Natur der Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung, warum diese Zellen fördern Krebsentwicklung statt, die an einer Anti-Tumor-Immunantwort, und kann dazu beitragen, neue Ziele zu kontrollieren finden.
Direkte Beobachtung durch Intravitalmikroskopie liefert Informationen über Zelldynamik in den Geweben von lebenden Mäusen 5. Ein Vierfarben-, Mehrbereich, Mikrolinsen-Spinnplatte konfokales System wurde entwickelt, um Stromazellen in Brusttumoren 6 zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die langfristige, kontinuierliche Bildgebung und umfasst mehrere Vorteile, wie (a) schnelle Bilderfassung, um Bewegungsartefakte zu minimieren, (b) langfristige Anästhesie, (c) vier Farberfassung auf verschiedenen Zelltypen zu folgen, (d) Fluoreszenzmarkierung verschiedener Tumorkomponenten, und (e) Beobachtung verschiedener Tumormikroumgebung witHin die gleiche Maus Maus Maus Variabilität 7-9 zu vermeiden. Mit dieser Technik wurden verschiedene Zellverhalten in dem Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor angetrieben Polyoma mittleren T-Onkogen (PyMT) Modell, das schrittweise von Tumorgenese zeigt gemeldet. Regulatorische T-Lymphozyten (Treg, von der Foxp3 EGFP-Transgens sichtbar) wandern bevorzugt in der Nähe der Blutgefäße in der Erwägung, DC (CD11c-DTR-EGFP), Karzinom-assoziierte Fibroblasten (Fsp1 + / + -EGFP) und myeloischen Zellen (c-fms -EGFP) weisen höhere Beweglichkeit in der Tumorperipherie als innerhalb der Tumormasse. Im Zustand der akuten systemischen Hypoxie, wanderten Zellen anders: Tregs stoppen Migration im Gegensatz zu myeloischen Zellen, die sich zu bewegen 6 fort. Zusätzlich wird in der gleichen Mausmodell wurde gezeigt, dass Doxorubicin Empfindlichkeitsänderungen mit Tumorstadium wird Arzneimittelverteilung Arzneimittelantwort und Doxorubicin bezogenenBehandlung führt zu CCR2-abhängigen Rekrutierung von myeloischen Zellen zu Tumoren. So können Live-Bildgebung auch verwendet, um Einblicke in die Arzneimittelreaktionen in situ und die Biologie der Chemoresistenz 10,11 zu gewinnen.
Adenomatöse Polyposis coli (APC)-Gen-Mutationen treten häufig in menschlichen kolorektalen Adenomen und Karzinomen 12 und Mutation eines einzelnen Kopie des Gens Ergebnisse von APC im familiären adenomatösen Polyposis (FAP), die ein extrem hohes Risiko für Darmkrebs 13 verleiht. Der Maus-Stamm Apc Min / + trägt eine Trunkierungsmutation an Codon 850 des APC-Gens und entwickelt spontan mehreren intestinalen Adenomen ganzen Dünndarm 14-16. Langfristige intravitalen Bildgebung des Darms ist schwierig, weil der Invasivität des Verfahrens, da das Öffnen der Bauchhöhle, die für den Zugriff auf den Darm. Kurzfristige Live-Bildgebung studies wurden zuvor an gesunden Darm 17,18 veröffentlicht, aber die langfristige direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde nicht berichtet. Ein chirurgisches Verfahren wurde entwickelt und verfeinert, um Tumore über die serösen Oberfläche des Darms sichtbar zu machen, mit der sich drehenden Scheibe Intravitalmikroskopie System vorher auf Bild Brusttumoren 6,10 verwendet. In diesem Beitrag wird ein Protokoll beschrieben, das eine um das Verhalten von myeloischen Zellen in den Tumoren im Dünndarm unter Verwendung von Apc Min / +-Mäusen folgen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Beitrag wird ein detailliertes Protokoll für die drehende Scheibe konfokale Bildgebung von myeloiden Zelldynamik im Darmtumoren für mehrere Stunden in einem lebenden Tier, von der Serosa-Seite des Darm abgebildet beschrieben.
Um Entzündungen zu verhindern und eine optimale physiologische Bedingungen, Bildgebung des Darms hat auf die intakte Organ erfolgen. Allerdings ist aus der Abbildungs Serosaseite Darm herausfordernd, da das Licht durch verschiedene Gewebeschichten, wi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Ying Yu für Apc Min / + Mäusen Genotypisierung danken. Diese Studie wurde durch Mittel aus INSERM und Zuschüsse (CA057621 und AI053194) von den National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
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