In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
Cellule mieloidi sono i più abbondanti cellule immunitarie all'interno di tumori e hanno dimostrato di promuovere la progressione tumorale. Le moderne tecniche di imaging intravitale permettono l'osservazione del comportamento cellulare dal vivo all'interno dell'organo, ma può essere difficile in alcuni tipi di cancro a causa di organo e tumore accessibilità, come l'intestino. L'osservazione diretta dei tumori intestinali non è stato segnalato in precedenza. Una procedura chirurgica qui descritta permette l'osservazione diretta delle dinamiche di cellule mieloidi all'interno dei tumori intestinali nei topi dal vivo utilizzando topi transgenici reporter fluorescente e traccianti iniettabili o anticorpi. A questo scopo, è stato utilizzato un quattro-colore, multi-regione, disco rotante microscopio confocale micro-lensed che consente a lungo termine di imaging continuo con l'acquisizione rapida di immagini. Apc Min / + topi che sviluppano più adenomi nel piccolo intestino è attraversato con i topi c-fms-EGFP per visualizzare le cellule mieloidi e con i topi ACTB-ECFPper visualizzare le cellule epiteliali intestinali delle cripte. Sono inoltre descritte le procedure per etichettare diversi componenti tumorali, come i vasi sanguigni e neutrofili, e la procedura per il posizionamento del tumore per l'imaging attraverso la superficie sierosa. Filmati time-lapse compilati da diverse ore dell'imaging consentono l'analisi del comportamento delle cellule mieloidi in situ nel microambiente intestinale.
Introduction
Prove schiaccianti ora dimostra che il microambiente tumorale, costituito da popolazioni cellulari eterogenee, inclusi i fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e infiammatorie, matrice extracellulare e fattori solubili, svolge un ruolo cruciale nella iniziazione e progressione dei tumori solidi contribuendo a quasi tutti caratteristiche di cancro 1. Infatti, durante la progressione del tumore, ci sono costanti interazioni dinamiche tra cellule tumorali trasformate e le cellule stromali che si evolvono per generare un microambiente favorevole alla malignità 2. Tra le cellule immunitarie che infiltrano il microambiente tumorale, le cellule mieloidi sono i più abbondanti 3. Composto da macrofagi associati al tumore (TAM), derivati da cellule mieloidi soppressore (MDSCs), cellule dendritiche (DC) e neutrofili (PMN), le cellule mieloidi sono reclutati dal midollo osseo e progressivamente si infiltrano i tumori, rilasciando citochine, fattori di crescita e proteasi che può promuoverela crescita del tumore e la diffusione 4. Il crosstalk tra le cellule tumorali e le cellule mieloidi è complessa ma dinamica. Così la comprensione della natura delle loro interazioni è fondamentale per determinare il motivo per cui queste cellule favoriscono la progressione del cancro, invece di partecipare a una risposta immunitaria anti-tumorale, e può aiutare a trovare nuovi obiettivi per controllarlo.
L'osservazione diretta al microscopio intravitale fornisce informazioni sulle dinamiche delle cellule all'interno dei tessuti di topi vivi 5. A quattro colori, multi-regione, disco rotante micro-lensed sistema confocale è stato progettato per studiare le cellule stromali all'interno di tumori mammari 6. Questo approccio consente di imaging continuo a lungo termine e comprende diversi vantaggi, come (a) acquisizione immagini rapide per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, (b) l'anestesia-lungo termine, (c) l'acquisizione di quattro colori di seguire diversi tipi di cellule, (d) l'etichettatura fluorescente delle diverse componenti tumorali, e (e) l'osservazione di diversi microambienti tumorali within lo stesso mouse per evitare il mouse per variabilità del mouse 7-9. Con questa tecnologia, i comportamenti cellulari diversi sono stati riportati nel virus del tumore mammario (MMTV) promotore-driven polioma middle T oncogene (PyMT) modello che mostra le fasi progressive della tumorigenesi. Regolamentazione linfociti T (Tregs, visualizzati dal transgene Foxp3 EGFP) migrare preferenzialmente in prossimità di vasi sanguigni che il DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblasti carcinoma-associata (Fsp1 + / + -EGFP) e cellule mieloidi (c-fms -EGFP) presentano elevata motilità alla periferia del tumore rispetto all'interno della massa tumorale. Nella condizione di ipossia sistemica acuta, le cellule migrate in modo diverso: Tregs fermare la migrazione al contrario di cellule mieloidi che continuano a muoversi 6. Inoltre, nello stesso modello di topo, è stato dimostrato che le variazioni di sensibilità doxorubicina con stadio tumorale, distribuzione del farmaco è legato alla risposta ai farmaci, e doxorubicinatrattamento porta al reclutamento CCR2-dipendente delle cellule mieloidi ai tumori. Così, l'imaging dal vivo può essere utilizzato anche per acquisire conoscenze in risposta ai farmaci in situ e la biologia di chemioresistenza 10,11.
Poliposi adenomatosi coli (APC) mutazioni del gene comunemente si verificano in adenomi colorettali umani e carcinomi 12 e mutazione di una singola copia dei risultati gene APC nella poliposi adenomatosa familiare (FAP), che conferisce un altissimo rischio di cancro al colon 13. Il ceppo di topi Apc Min / + porta una mutazione troncamento al codone 850 del gene Apc e si sviluppa spontaneamente più adenomi intestinali tutto il piccolo intestino da 14 a 16. A lungo termine intravitale imaging dell'intestino è impegnativo a causa della invasività della procedura, poiché l'apertura della cavità peritoneale è necessaria per l'accesso a livello intestinale. A breve termine l'imaging dal vivo studies sono stati precedentemente pubblicati sulla salute dell'intestino 17,18, ma l'osservazione diretta a lungo termine dei tumori intestinali non è stato riportato. Una procedura chirurgica è stato progettato e perfezionato per visualizzare i tumori attraverso la superficie sierosa dell'intestino, utilizzando il sistema di microscopia a disco rotante intravitale precedentemente utilizzato per i tumori della mammella immagine 6,10. In questo lavoro, un protocollo è descritto che permette di seguire il comportamento delle cellule mieloidi all'interno dei tumori del piccolo intestino utilizzando Apc Min / + topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro, un protocollo dettagliato è descritto per la filatura del disco confocale delle dinamiche di cellule mieloidi in tumori intestinali per diverse ore in un animale vivo, ripresa dal lato sierosa dell'intestino.
Per evitare l'infiammazione e di avere condizioni fisiologiche ottimali, imaging dell'intestino deve essere fatto sull'organo intatta. Tuttavia, l'imaging dal lato sierosa dell'intestino è impegnativo, poiché la luce deve passare attraverso d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Ying Yu per Apc Min / + topi genotipizzazione. Questo studio è stato sostenuto da fondi provenienti da INSERM e sovvenzioni (CA057621 e AI053194) dal National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
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