골수 세포 역학의 실시간 영상<em> APC<sup> 최소 / +</sup</em> 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
골수 세포는 종양 내에서 가장 풍부한 면역 세포이며 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다. 현대의 intravital 이미징 기술은 기관 내부의 살아있는 세포 행동의 관찰을 가능하게되지만, 소장으로 인한 장기 및 종양 접근성 일부 암에서 문제가 될 수 있습니다. 장내 종양의 직접적인 관찰은 이전에보고되지 않았습니다. 여기에 설명 된 수술은 형질 전환 형광 기자 마우스와 주사 추적자 또는 항체를 사용하여 살아있는 생쥐의 장내 종양 내에서 골수 세포 역학의 직접 관찰 할 수 있습니다. 이를 위해, 신속한 화상 취득 장기 연속 촬상을 허용 4 색 멀티 영역, 마이크로 렌즈 효과 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하고있다. 교차 소장의 여러 선종 개발 APC 최소 / + 마우스 골수 세포를 시각화하는 C-FMS-EGFP 마우스와 ACTB-ECFP 마우스와 함께지하실의 장 상피 세포를 시각화합니다. 이러한 혈관 및 호중구 및 장막 표면을 통해 이미징 종양을 위치시키기위한 절차와 다른 종양 성분을 라벨링하는 절차도 설명된다. 영상의 몇 시간에서 컴파일 시간 경과 영화는 장 미세 환경에서 현장에서 골수 세포 행동의 분석을 할 수 있습니다.
Introduction
절대적인 증거 해주기 섬유 아세포, 내피 세포, 면역 및 염증 세포, 세포 외 기질, 및 가용성 인자를 포함한 이종 세포 집단 이루어진 종양 미세 환경은, 거의 모든 기여함으로써 개시 및 고형 종양의 진행에 중요한 역할을한다는 것을 보여 암 하나의 특징. 사실상, 종양 진행 중에, 악성 종양이 유리한 미세 환경을 생성하도록 형질 전환 된 진화 암세포 및 간질 세포 간의 일정한 동적 상호 작용이있다. 종양 미세 환경에 침투 면역 세포 중 골수 세포는 세 가장 풍부하다. (TAM) 종양 관련 대 식세포로 구성된 골수 유래 억제 세포 (MDSCs), 수지상 세포 (DC) 및 호중구 (백혈구), 골수 세포는 골수에서 모집하고 점진적으로 사이토 카인, 성장 인자 및 단백질 분해 효소 방출, 종양에 침투 홍보 할 수 있습니다종양의 성장 및 4를 확산. 암 세포와 골수 세포 사이의 크로스 토크는 복잡하지만 동적이다. 따라서, 상호 작용의 성질에 대한 이해는 이들 세포 대신 항 종양 면역 반응에 참여하는 암의 진행을 촉진 결정하는 중요한 이유이며, 그것을 제어하기위한 새로운 타겟을 찾는 데 도움이 될 수있다.
의 intravital 현미경으로 직접 관찰은 살아있는 쥐 5의 조직 내에서 세포 역학에 대한 정보를 제공합니다. 이 4 색은, 다중 영역은 마이크로 렌즈 효과 회전 디스크 촛점 시스템은 유방 종양 6 내의 간질 세포를 연구하기 위해 디자인되었다. 이 방법은 장기의 연속 영상을 구현하고 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 (a) 급 이미지 획득, (b) 장기 마취, (c) 상이한 세포 유형을 따르는 네 가지 색상 취득, (D), 형광 표지 등의 여러 장점을 포함 다른 종양 구성 요소 및 다른 종양 미세 환경의 재치 (E) 관찰같은 마우스를 힌 것은 마우스 변동성 7-9로 마우스를 방지 할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 다른 세포 행동은 종양의 진보적 인 단계를 표시하는 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 중심 폴리오 중간 T 종양 유전자 (PyMT) 모델에서보고되었다. (Foxp3의 EGFP 형질 전환 유전자에 의해 시각 Tregs) 혈관에 근접 우선적으로 마이그레이션 규제 T 림프구 수지상 (의 CD11c-DTR-EGFP), 암 관련 섬유 아세포 (Fsp1 + / +-EGFP) 및 골수 세포 (C-FMS 반면, -EGFP)은 종양 덩어리 내에보다 종양 주변부에서 높은 운동성을 나타낸다. 급성 전신 저산소증의 상태에서 세포는 다른 마이그레이션 : Tregs는 6 계속 이동 골수 세포는 대조적으로 마이그레이션 중지합니다. 또한, 동일 마우스 모델에서, 종양은 단계와 그 독소루비신 감도 변화를 도시 한 약물 분포를 약물 반응, 및 독소루비신 관련된치료는 종양 세포의 골수 CCR2 의존적 채용 리드. 따라서, 라이브 영상도 현장에서 약물 반응에 대한 통찰력과 chemoresistance 10, 11의 생물학을 높일 수 있습니다.
선종 성 용종증 대장균 (APC) 유전자 돌연변이는 일반적으로 인간의 대장 선종 및 암 (12)과 대장 암 (13)에 대한 매우 높은 위험을 수여 가족 성 선종 성 용종증 (FAP)에있는 APC 유전자 결과의 단일 사본의 돌연변이에서 발생합니다. 마우스 변형 APC 최소 / +는 APC 유전자의 코돈 850의 절단 돌연변이를 수행하고 자발적으로 모든 소장 14 ~ 16에 걸쳐 여러 장 선종을 개발하고 있습니다. 복강을 여는 부위에 액세스하기위한 필요가 있기 때문에 소장의 장기의 intravital 이미징 때문에 절차의 침습성의 도전이다. 단기 라이브 영상 성udies는 이전에 건강한 장 (17, 18)에 간행되었지만, 장내 종양의 장기 직접 관찰은보고되지 않았습니다. 수술 이전 화상 유방 종양 6,10 사용의 intravital 스피닝 디스크 현미경 시스템을 사용하여 설계 및 소장의 장막면을 통해 종양 시각화 정제되었다. 이 논문에서, 프로토콜은 하나의 APC 최소 / + 마우스를 사용하여 소장 종양 내 골수 세포의 행동을 수행 할 수 있다는 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 논문에서는 상세한 프로토콜은 창자의 장막 측에서 몇 군데 살아있는 동물에서 몇 시간 동안 장내 종양에서 골수 세포 역학의 디스크 공 촛점 이미징 회전에 설명되어 있습니다.
염증을 방지하기 위해 최적의 생리 학적 조건을 가지고, 소장의 이미지는 그대로 기관에서 수행해야합니다. 광이 도달하기 전에 상피 평활근 같은 상이한 조직 층을 통과해야하기 때문에, 소장?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 APC 최소 / + 마우스의 유전자형에 대한 잉 유에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 INSERM에서 자금과 국립 보건원에서 보조금 (CA057621 및 AI053194)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
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