التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em> APC<sup> مين / +</sup</em> الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
خلايا الدم النخاعي هي الأكثر وفرة الخلايا المناعية داخل الأورام وثبت لتعزيز تطور الورم. تقنيات التصوير الحديثة حيوي داخلي تمكن مراقبة سلوك الخلايا الحية داخل الجهاز لكن يمكن أن يكون تحديا في بعض أنواع السرطان بسبب ورم الجهاز والوصول مثل الأمعاء. الملاحظة المباشرة من الأورام المعوية لم يتم ذكر سابقا. إجراء العمليات الجراحية الموصوفة هنا يسمح الملاحظة المباشرة للديناميات خلية الدم النخاعي داخل الأورام المعوية في الفئران الحية المعدلة وراثيا باستخدام الفئران مراسل فلوري واستشفاف طريق الحقن أو الأجسام المضادة. لهذا الغرض، تم استخدام أربعة ألوان، متعددة المنطقة،-بعدسات الصغرى القرص الغزل المجهر متحد البؤر التي تتيح التصوير المستمر طويل الأمد مع الحصول على الصور السريع. APC مين / + الفئران التي تطور أورام متعددة في الأمعاء الدقيقة وعبروا مع الفئران C-FMS-EGFP لتصور خلايا الدم النخاعي ومع الفئران ACTB-ECFPلتصور الخلايا الظهارية في الأمعاء من الخبايا. كما وصف الإجراءات لوصفها مكونات الورم مختلفة، مثل الأوعية الدموية والعدلات، وإجراءات تحديد المواقع الورم للتصوير من خلال سطح المصلي. الوقت الفاصل بين الأفلام التي تم تجميعها من عدة ساعات من التصوير تسمح للتحليل سلوك الخلية النخاعي في الموقع في المكروية المعوية.
Introduction
أدلة دامغة يوضح الآن أن المكروية الورم، وتتألف من السكان الخلية غير متجانسة، بما في ذلك الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، الخلايا المناعية والتهابات، ومصفوفة خارج الخلية، والعوامل القابلة للذوبان، يلعب دورا حاسما في بدء وتطور الأورام الصلبة من خلال المساهمة في تقريبا جميع بصمات السرطان 1. في الواقع، خلال تطور الورم، وهناك تفاعلات ديناميكية مستمرة بين الخلايا السرطانية والخلايا تتحول انسجة أن تتطور لتوليد المكروية مواتية لخباثة 2. بين الخلايا المناعية التي تتسلل المكروية الورم، وخلايا الدم النخاعي هي الأكثر وفرة 3. تتألف من الضامة المرتبطة الورم (TAM)، المشتقة من خلايا النخاعي القامع (MDSCs)، والخلايا الجذعية (DC) والعدلات (PMNs)، يتم تجنيد خلايا الدم النخاعي من نخاع العظام والأورام التسلل تدريجيا، والإفراج عن السيتوكينات وعوامل النمو والبروتياز التي يمكن أن تعززتنتشر نمو الورم و4. الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية وخلايا الدم النخاعي معقد ولكن الديناميكي. وبالتالي فهم طبيعة تفاعلاتها هو أمر حاسم لتحديد سبب هذه الخلايا تعزيز تطور السرطان بدلا من المشاركة في الاستجابة المناعية المضادة للورم، ويمكن أن تساعد على إيجاد أهداف جديدة للسيطرة عليها.
الملاحظة المباشرة من قبل intravital المجهري توفر معلومات عن ديناميات الخلايا داخل أنسجة الفئران الحية 5. وهناك أربعة ألوان، متعددة المنطقة، وقد صمم القرص الغزل بعدسات نظام متحد البؤر الصغيرة لدراسة خلايا انسجة داخل الأورام الثديية 6. هذا النهج يتيح التصوير المستمر على المدى الطويل، ويشمل العديد من المزايا مثل (أ) اقتناء الصور السريعة لتقليل الحركة الفنية، (ب) التخدير على المدى الطويل، (ج) أربعة اكتساب اللون لمتابعة أنواع مختلفة من الخلايا، (د) وضع العلامات الفلورية مكونات ورمي مختلفة، و (ه) مراقبة مختلف microenvironments الورم الطرافةهين نفس الماوس لتجنب الماوس لتقلب الماوس 7-9. مع هذه التكنولوجيا، وقد تم الإبلاغ عن السلوكيات مختلفة من الخلايا في فيروس الورم الثديية (MMTV) يحركها المروج التورام منتصف T الجين الورمي (PyMT) النموذج الذي يعرض مراحل متقدمة من تكون الأورام. الخلايا اللمفاوية التائية التنظيمية (Tregs، تصور من قبل التحوير Foxp3 EGFP) الهجرة تفضيلي في قربها من الأوعية الدموية في حين أن البلدان النامية (CD11c و-DTR-EGFP)، الخلايا الليفية المرتبطة سرطان (Fsp1 + / + -EGFP) وخلايا الدم النخاعي (ج-FMS -EGFP) تظهر ارتفاع الحركة في محيط الورم من داخل كتلة الورم. في حالة نقص الأكسجين الحاد النظامية، هاجرت خلايا مختلفة: Tregs وقف الهجرة على النقيض من خلايا الدم النخاعي أن مواصلة التحرك 6. بالإضافة إلى ذلك، في نموذج الفأر نفسه، وقد تبين أن التغييرات حساسية دوكسوروبيسين مع مرحلة الورم، ويرتبط توزيع المخدرات إلى الاستجابة للدواء، ودوكسوروبيسينالعلاج يؤدي إلى تجنيد تعتمد على CCR2 من خلايا الدم النخاعي للأورام. وهكذا، ويمكن أيضا أن تستخدم التصوير الحي للحصول على نظرة ثاقبة الردود المخدرات في الموقع وبيولوجيا مقاومة كيميائية 10،11.
رميغدي البوليبات القولونية (APC) الطفرات الجينية تحدث عادة في أورام القولون والمستقيم وسرطان الإنسان 12 وتحور نسخة واحدة من الجين APC نتائج في المرجلات غدومي العائلية (FAP)، الذي يضفي على مخاطر عالية جدا لسرطان القولون 13. سلالة الماوس APC مين / + يحمل طفرة اقتطاع في كودون 850 من الجين APC ويتطور بشكل عفوي أورام الأمعاء متعددة في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة 14- 16. على المدى الطويل التصوير حيوي داخلي من الأمعاء يمثل تحديا بسبب الغزو من الإجراء، منذ فتح التجويف البريتوني من الضروري للوصول إلى الأمعاء. على المدى القصير التصوير الحي الحادي وتم udies المنشورة سابقا على الأمعاء صحي 17،18، ولكن لم يتم الإبلاغ عن الملاحظة المباشرة طويلة الأجل الأورام المعوية. وقد تم تصميم وإجراء العمليات الجراحية وصقلها لتصور الأورام من خلال سطح المصلي للأمعاء، وذلك باستخدام نظام الغزل حيوي داخلي المجهري القرص المستخدمة سابقا لأورام الثدي صورة 6،10. في هذه الورقة، وصفت البروتوكول الذي يسمح احد لاتباع سلوك خلايا الدم النخاعي داخل الأورام في الأمعاء الدقيقة باستخدام APC مين / + الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة، يتم وصف بروتوكول مفصل عن الغزل القرص التصوير متحد البؤر ديناميات خلية الدم النخاعي في الأورام المعوية لعدة ساعات في الحيوانات الحية، التقط من الجانب المصلي للأمعاء.
لتجنب الالتهاب وأن الظروف الفسيولوجية الأمثل، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر يو لينغ مين APC / + الفئران التنميط الجيني. وأيد هذه الدراسة من قبل أموال من INSERM والمنح (CA057621 و AI053194) من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
