قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)
Summary
سطح مأكل مثل الطحين الرنين (SPR) هو وسيلة خالية من التسمية للكشف عن التفاعلات الحيوية الجزيئية في الوقت الحقيقي. هنا، على بروتوكول لبروتين الغشاء: وصفت التجربة تفاعل مستقبلات، أثناء مناقشة إيجابيات وسلبيات هذه التقنية.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
تفاعلات البروتين البروتين (PPI)؛ تشكيل والتفكك المجمعات البروتين، هي الأحداث الرئيسية في العديد من العمليات البيولوجية (على سبيل المثال، والنسخ، والنسخ والترجمة والإشارات والاتصالات خلية خلية). وغالبا ما تجرى دراسات شبه الكمية للPPI باستخدام التجارب المناعية هطول الأمطار المنسدلة أو. ومع ذلك، فإن هذه (وما شابهها) التقنيات محدودة في حدود الانتماءات التي يمكن قياسها (منخفض مكرومولي وأعلى النسب) وذلك بسبب خطوات الغسيل التي هي ملازمة لمثل هذه التقنيات. هذه التقنيات "نقطة النهاية" لا يمكن تحديد التفاعلات تقارب عابرة أو المنخفضة التي غالبا ما تكون من العواقب البيولوجية كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القرار الزماني لهذه النهج محدودة جدا، وعادة أوامر من حجم أبطأ من معدلات التفاعل. SPR يتغلب على هذه العيوب نتيجة لحالة من الحساسية وقراره الصدغي العلوي 1،2. SPR هي طريقة خالية من التسمية، وعلى هذا النحوويمكن قياس التفاعل الجزيئي (طالما أن يتم الكشف عن التغييرات الكتلة). بالإضافة إلى مؤشر أسعار المنتجين، وقد تم استخدامه على نطاق واسع لوصف البروتين يجند والبروتين المخدرات (أو جزيء صغير)،-DNA والبروتين، وتفاعلات البروتين RNA 3-5. وتسجل النتائج وتآمر في الوقت الحقيقي، والذي تمكن من تعديل السريع للظروف تجريبية والتصميم التجريبي مرونة.
مبدأ المادية وراء أدوات SPR مقرها هو الاستفادة من النظام البصري الذي يقيس تغيير معامل الانكسار على سطح استشعار على تغيير كتلة 2. ويجمد أحد الشركاء التفاعل (الآخرة يجند) على شريحة البوليمر المصفوفة والجزيء الثاني (الآخرة الحليلة) وتدفقت على السطح. الحليلة ملزمة ليجند يغير كتلة على سطح رقاقة. ويرتبط هذا كتلة التغيير مباشرة وبشكل متناسب مع التغيرات في معامل الانكسار من السطح. يتم رسم النتائج في الوقت الحقيقي، وكما عرضت وحدة استجابة (RU) بوصفها وظيفة من الزمن. ويطلق على مثل هذه المؤامرة على sensogram (على سبيل المثال، الشكل 1). منذ SPR يتبع دوام كامل للتفاعل، وتستمد قبل التوازن الثوابت معدل الحركية، بالإضافة إلى التوازن الانتماءات. كما هو مفصل أدناه، سلوك ما قبل توازن نظام معين يحمل الكثير من المعلومات، ويوفر وجهة نظر مختلفة جدا من التوازن وحدها. مرة واحدة يتم معايرة النظام، والتجارب سريعة جدا وتتطلب كميات صغيرة فقط من مادة البروتين (ميكروجرام لنانوغرام كميات). جمع المعلومات الحركية الكاملة لنظام معين لا يمكن أن يتحقق في غضون أيام. حساسية عالية من SPR تتيح القياسات التي لا يمكن استخدام أي تقنية أخرى (6). ومع ذلك، هذه الحساسية العالية هو "سيف ذو حدين" لأنه يمكن أن تكون مصدرا رئيسيا للبيانات إيجابية كاذبة. يتم تسجيل أي عامل يؤثر على مؤشر يعكس وتآمر على sensogram. على هذا النحو، ا ف بيجب استخدام الضوابط مالئمة للقضاء على ايجابيات كاذبة، وينصح للغاية بدعم من نهج تكميلية.
ويوضح الشكل (1) تطور تجربة البرنامج الخاصة باستخدام رقاقة الاستشعار NTA المغلفة. وsensogram في لوحة ويظهر حقن أيونات النيكل على مصفوفة NTA (بيانات unsubtracted)، والألواح BD عرض البيانات بعد طرح إشارة المشتقة من خلية مراقبة سلبية. الأحمر والأسهم الزرقاء تظهر حقن بداية ونهاية، على التوالي. الشلل في يجند على رقاقة يغير تدريجيا كتلة حتى يتم إنهاء الحقن. الهضبة مستقرة لوحظ بعد انتهاء الحقن يجند لتعكس جمعية مستقرة من يجند إلى السطح (الشكل 1B، دورة 2). مرة واحدة يتم التوصل إلى خط الأساس مستقر يتم حقن منطقة عازلة على يجند والخلية المرجعية (1B الشكل، دورة 3) يخدم حقن .هذا ك "السيطرة على بياض"، وسيكونتطرح أثناء التحليل. على حقن، يتم تسجيل التغييرات الطفيفة، مما يعكس تدفق كتلة من خلال رقاقة. ثم في دورة منفصلة (1B الشكل، ودورة 4)، يتم حقن الحليلة. الزيادة التدريجية في RU تمثل جمعية الحليلة ليجند. مواقع الربط تصبح احتلت تدريجيا حتى يتم التوصل إلى التوازن. حالما ينتهي الحقن، وانخفاض البرازيلية يعكس تفارق المجمع. من مثل sensograms قبل التوازن، والتوازن الثوابت معدل يمكن أن تستمد (انظر لاحقا). الشكل 1 يصور التفاعل عابرة بين يجند وتحليلها. عندما يكون التفاعل أكثر استقرارا، وانخفاض في مستوى RU أبطأ، ما يعكس انخفاض ك د.
هنا، نحن تصف تجربة البرنامج الخاصة التي تهدف إلى تحديد خصائص التفاعل بين نقل الغشاء (المنظفات تذوب) وشريك وظيفية لها، ركيزة لها وما شابه ذلك البروتين 6،7 ملزمة. وزارة الدفاع المختارنظام ايل هو ATP كاسيت ملزمة (ABC) نقل، ModBC-A من Archeaglobus fulgidus. وقد تم اختيار هذا النظام لنتائجها استنساخه للغاية، إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء، والكلاسيكية "تشغيل / إيقاف" أسعار الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، تتوفر لخدمة ضوابط السلبية أهمية عن النقل المتماثلات ABC. الناقل، يتم استخراج ModBC (يجند A) من الغشاء باستخدام المنظفات وتنقيته وثبتوا على رقاقة. من ذوبان شريك التفاعل، مودا، هو الحليلة. كعنصر تحكم يجند سلبي، يتم استخدام مختلف RbsBC نقل ABC ("يجند B").
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR هو وسيلة حساسة للغاية لدراسة التفاعلات الجزيئية، وغالبا ما يكون النهج الوحيد الذي يوفر رصد في الوقت الحقيقي من عابر (بعد مهمة) التفاعلات. ومن الأمثلة على ذلك التفاعل عابرة المقدمة في هذه الوثيقة، التي لا يمكن الكشف عنها بواسطة أي وسيلة أخرى (المقايسات المنسدلة، ال?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
Riferimenti
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. . Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. . Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
