Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)
Summary
Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
Protein-Protein-Interaktionen (PPI); die Bildung und Dissoziation von Proteinkomplexen, sind Schlüsselereignisse in vielen biologischen Prozessen (zum Beispiel der Replikation, Transkription, Translation, Signalisierung, Zell-Zell-Kommunikation). Semi-quantitative Studien der PPI sind oft unter Verwendung von Pull-Down-oder Immunpräzipitation Experimente. Jedoch sind diese (und ähnliche) Techniken im Bereich von Affinitäten, die gemessen werden kann (niedrigen mikromolaren und höhere Affinität) durch die Waschschritte, die bei einem solchen Verfahren sind beschränkt. Solche "Endpunkt" Techniken nicht identifizieren kann vorübergehend oder geringe Affinität Wechselwirkungen, die häufig von großem biologischen Konsequenzen sind. Zusätzlich wird die zeitliche Auflösung solcher Ansätze äußerst beschränkt, üblicherweise um Größenordnungen langsamer als die Raten der Reaktion. SPR überwindet diese Mängel durch seine erhöhte Sensibilität und überlegene Zeitauflösung 1,2. SPR ist eine markierungsfreie Methode, und als solchemolekulare Wechselwirkung gemessen werden kann (solange die Massenänderung festgestellt werden kann). Neben PPI wurde extensiv verwendet, um Protein-Ligand, Protein-Arzneistoff (oder kleines Molekül), Protein-DNA und Protein-RNA-Interaktionen 3-5 charakterisieren. Die Ergebnisse werden aufgezeichnet und in Echtzeit, was eine schnelle Abänderung der Versuchsbedingungen und Versuchs flexible Bauweise ermöglicht.
Das physikalische Prinzip hinter SPR basierte Instrumente besteht in der Verwendung eines optischen Systems, das eine Änderung des Brechungsindex misst auf der Sensoroberfläche auf Masse ändert 2. Einer der Wechselwirkungspartner (hiernach Liganden) auf einer Polymermatrix-Chip und das zweite Molekül (nachstehend Analyt) wird über der Oberfläche floß immobilisiert. Analyt-Bindung an den Liganden verändert die Masse auf der Chipoberfläche. Diese Massenänderung ist direkt und proportional zu Änderungen des Brechungsindex der Oberfläche bezogen. Die Ergebnisse werden in Echtzeit aufgezeichnet undals Reaktionseinheiten (RU) als eine Funktion der Zeit dargestellt. Eine solche Handlung ist eine Sensogramm bezeichnet (zB Abbildung 1). Da SPR folgt die komplette zeitliche Verlauf der Wechselwirkung werden Vorgleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet sind, zusätzlich zu den Affinitäten Gleichgewicht. Wie unten beschrieben, die Vor-Gleichgewichtsverhalten eines Systems hält viele Informationen und bietet eine ganz andere Perspektive als Gleichgewicht allein. Nachdem das System kalibriert ist, sind Versuche sehr schnell und benötigen nur geringe Mengen an Proteinmaterial (Mikrogramm Mengen Nanogramm). Sammeln des kompletten kinetischen Daten von einem gegebenen System kann in Tagen erreicht. Die hohe Empfindlichkeit von SPR-Messungen liefert, die nicht durch ein anderes Verfahren 6 sind möglich. Ist diese hohe Empfindlichkeit jedoch ein "zweischneidiges Schwert", da es eine der Hauptquellen für falsch positive Daten sein. Jeder Faktor, der den Brechungsindex beeinflusst wird aufgezeichnet und auf der Sensogramm. Als solche apsprechende Kontrollen müssen genutzt werden, um falsch-positive zu beseitigen, und die Unterstützung von komplementären Ansätzen wird dringend empfohlen.
Abbildung 1 zeigt den Verlauf einer SPR-Experiment unter Verwendung einer NTA-beschichteten Sensorchip. Die Sensogramm in Tafel A zeigt die Injektion von der Nickelionen über die NTA-Matrix (unsubtrahierter Daten) und Platten BD die Daten anzeigen nach Abzug des aus der negativen Kontrollzell abgeleiteten Signals. Rote und blaue Pfeile zeigen Einspritzbeginn und das Ende auf. Immobilisieren des Liganden auf den Chip schrittweise verändert, bis die Masse Einspritzung beendet. Das nach Beendigung der Einspritzung von Ligand beobachtet stabiles Plateau spiegelt die stabile Assoziation des Liganden an der Oberfläche (1B, Zyklus 2). Sobald eine stabile Basislinie erreicht ist ein Puffer gegenüber dem Liganden und der Referenzzelle (1B, Zyklus 3) .Dieses Injektion dient als "Blindkontrolle" eingespritzt, und werdenwährend der Analyse abgezogen. Nach der Injektion werden kleinere Änderungen aufgezeichnet, was eine Strömung von Masse durch den Chip. Dann in einem separaten Kreislauf (Abbildung 1B, Zyklus 4), der Analyt eingespritzt wird; Die schrittweise Erhöhung der RU stellt Verband des Analyten an den Liganden. Die Bindungsstellen allmählich besetzt, bis ein Gleichgewicht erreicht wird. Sobald Einspritzung endet, ein Rückgang der EVU spiegelt Dissoziation des Komplexes. Aus solchen Sensogramme Pre-Gleichgewicht und Gleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet werden können (siehe unten). Abbildung 1 zeigt eine transiente Interaktion zwischen dem Liganden und Analyten. Wenn die Interaktion ist stabiler, ist der Rückgang der EVU-Ebene langsamer, was auf einen geringeren k d.
Hier beschreiben wir eine SPR-Experiment am Charakterisieren der Wechselwirkung zwischen einem Membrantransporter (solubilisiertem) und seine funktionellen Partner seinen zugehörigen Substrat-Bindungsprotein 6,7 gerichtet. Die gewählte model-System ist ein ATP-Bindungs-Cassette (ABC) Transporter, ModBC-A von Archeaglobus fulgidus. Dieses System wurde für die sehr gut reproduzierbare Ergebnisse "on / off" Raten ausgewählt, hohem Signal-Rausch-Verhältnis und klassisch. Darüber hinaus sind Homologen ABC-Transporter zur Verfügung als wichtige negative Kontrollen dienen. Der Transporter, ModBC (Ligand A) von der Membran mit Reinigungsmittel, gereinigt und auf den Chip immobilisiert extrahiert. Seine löslichen Interaktionspartner, ModA ist der Analyt. Als Negativkontrolle Ligand wird eine andere ABC-Transporter RbsBC verwendet ("Ligand B").
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, um molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen, und ist oft der einzige Ansatz, der Echtzeit-Überwachung von vorübergehenden (noch wichtiger) Wechselwirkungen liefert. Ein Beispiel ist die vorübergehende Wechselwirkung hierin dargestellt, die nicht durch ein anderes Verfahren (Pull-down-Assays, Liposomen Sedimentation Assays 6) festgestellt werden konnte. Darüber hinaus, während andere Verfahren sind begrenzt, um Messungen Gleichgewicht (ob quantitativ oder qualita…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
Riferimenti
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. . Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. . Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
