В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)
Summary
Поверхностного плазмонного резонанса (SPR) представляет собой метод, свободной от этикетки для обнаружения био-молекулярных взаимодействий в реальном времени. При этом протокол для мембранного белка: эксперименте взаимодействие с рецептором описана, обсуждая плюсы и минусы этого метода.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
Белок-белковых взаимодействий (PPI); Образование и диссоциация белковых комплексов, являются ключевые события во многих биологических процессах (например, репликация, транскрипция, трансляция, сигнализация, клетка-клетка связи). Полу-количественные исследования ИПП часто выполняются с использованием выпадающее меню или иммуно-осадков эксперименты. Тем не менее, эти (и подобные) методы ограничены в диапазоне от сродства, которые могут быть измерены (низкий микромолей и более высоким сродством) в связи с этапов промывки, которые присущи таких методов. Такие методы "конечной точки" не может определить переходные или низким сродством взаимодействия, которые часто больших биологических последствий. Кроме того, временное разрешение таких подходов является крайне ограниченным, как правило, порядков медленнее, чем темпы реакции. SPR преодолевает эти недостатки из-за его повышенной чувствительностью и превосходной временным разрешением 1,2. SPR представляет собой способ, свободной от этикетки, и, таким образоммолекулярное взаимодействие может быть измерена (при условии, что изменения массы могут быть обнаружены). В дополнение к ИПП, он широко используется для характеристики белка-лиганд, белок-лекарство (или малую молекулу), белок-ДНК и белок-РНК взаимодействий 3-5. Результаты записываются и нанесены в реальном времени, что позволяет быстрое изменение условий эксперимента и гибкой эксперимента.
Физический принцип позади инструментов, основанных SPR является использование оптической системы, которая измеряет изменение показателя преломления на поверхности датчика при изменении массы 2. Один из взаимодействующих партнеров (далее лиганд) иммобилизуют на чипе полимерной матрицы и второй молекулы (далее аналита) протекает по поверхности. Аналит связывания с лигандом изменяет массу на поверхности чипа. Это изменение массы непосредственно и пропорционально связан с изменением показателя преломления поверхности. Результаты приведены в реальном времени ипредставлены в виде единиц отклика (RU) как функции времени. Такой участок называется Сенсограмма (например, Рисунок 1). Поскольку SPR следующим полный временной ход взаимодействия, предварительно равновесные константы кинетической скорости получены, в дополнение к равновесию аффинности. Как подробно описано ниже, предварительно равновесное поведение данной системы имеет много информации, и обеспечивает очень различные точки зрения, чем только равновесия. После того, как система калибруется, эксперименты очень быстро и требуют только небольших количеств белкового материала (мкг на нг количество). Сбор полную кинетическую информацию о данной системе может быть достигнуто в дни. Высокая чувствительность SPR обеспечивает измерения, которые невозможно с помощью любого другого способа 6. Тем не менее, это высокая чувствительность является "палка о двух концах", поскольку это может быть основным источником ложных положительных данных. Любой фактор, который влияет на отражающую индекс записывается и отображается на Сенсограмма. В качестве такого, APуправления щих образовательных должны быть использованы для устранения ложных срабатываний и поддержки со стороны взаимодополняющих подходов Настоятельно рекомендуется.
Рисунок 1 иллюстрирует развитие ППР эксперимента с использованием НТА-покрытием сенсорного чипа. Сенсограмма в панели А показан инъекции ионов никеля по матрице NTA (безвычитательных данных), и панели BD отображать данные после вычитания сигнала, извлеченного из отрицательного клетки управления. Красные и синие стрелки показывают начало и конец впрыска, соответственно. Иммобилизация лиганда на чипе постепенно изменяет массу до инъекции не будет прекращено. Стабильный плато наблюдается после прекращения введения лиганда отражает стабильную ассоциацию лиганда к поверхности (фиг 1B, цикл 2). После того, как стабильный базовый достигается буфер вводят в течение лиганда и опорной ячейки (рис 1B, цикл 3) .Этот инъекции служит в качестве "пустой" контроль, и будетвычитается при анализе. После инъекции, незначительные изменения записываются, отражающие поток массы через чип. Затем в отдельном цикле (Фиг.1В, цикл 4), аналит вводится; Постепенное увеличение RU представляет собой объединение анализируемого вещества в с лигандом. Сайты связывания становятся постепенно заняли пока равновесие не будет достигнуто. Как только заканчивается инъекции, снижение на Руси отражает диссоциацию комплекса. Из таких sensograms константы скорости предравновесных и равновесные могут быть получены (см ниже). Рисунок 1 изображает кратковременное взаимодействие между лигандом и анализируемым веществом. Когда взаимодействие является более стабильным, снижение уровня RU медленнее, отражая более низкую Уб.
Здесь мы опишем ППР эксперимент по характеризующие взаимодействие между мембраной транспортера (моющее средство растворяют) и его функциональная партнера, его родственным субстрат-связывающий белок 6,7. Выбран модСистема Эл ATP связывающего кассетного (ABC) транспортер, ModBC-из Archeaglobus fulgidus. Эта система была выбрана для его высокую воспроизводимость результатов, высокое отношение сигнал-шум, и классический "вкл / выкл" ставок. Кроме того, гомологи ABC транспортеры доступны в качестве важных отрицательных контролей. Транспортер, ModBC (лиганд) извлекают из мембраны с использованием моющего средства, очищают и иммобилизованного на чипе. Его растворим взаимодействия партнер Moda, является анализируемого вещества. В качестве отрицательного лиганда управления, отличается ABC Transporter RbsBC используется ("лиганд B").
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR является высокочувствительным методом для изучения молекулярных взаимодействий, и часто единственный подход, который обеспечивает мониторинг в режиме реального времени переходных (еще важных) взаимодействий. Примером может служить переходный взаимодействия, представленные здес?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
Riferimenti
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. . Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. . Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
