Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)
Summary
Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
Interazioni proteina-proteina (PPI); la formazione e la dissociazione di complessi proteici, sono eventi chiave in molti processi biologici (ad esempio, la replicazione, la trascrizione, traduzione, di segnalazione, di comunicazione cellula-cellula). Studi semi-quantitativa di PPI sono spesso eseguiti con pull-down o esperimenti di immuno-precipitazione. Tuttavia, queste tecniche (e simili) sono limitati nella gamma di affinità che può essere misurata (basso e maggiore affinità micromolare) per le fasi di lavaggio che sono inerenti a tali tecniche. Tali tecniche "end-point" non in grado di identificare le interazioni affinità transitori o bassi che sono spesso di grandi conseguenze biologiche. Inoltre, la risoluzione temporale di tali approcci è estremamente limitato, solitamente ordini di grandezza più lento rispetto ai tassi di reazione. SPR supera queste carenze per la sua sensibilità e risoluzione temporale superiore a 1,2. SPR è un metodo privo di etichette, e come taleinterazione molecolare può essere misurata (purché le variazioni di massa possono essere rilevati). Oltre a PPI, è stato ampiamente utilizzato per caratterizzare la proteina-ligando, proteina-farmaco (o piccola molecola), proteina-DNA, e le interazioni proteina-RNA 3-5. I risultati sono registrati e tracciati in tempo reale, che consente una rapida modifica delle condizioni sperimentali e il disegno sperimentale flessibile.
Il principio fisico dietro strumenti basati SPR è l'utilizzo di un sistema ottico che misura un cambiamento dell'indice di rifrazione sulla superficie del sensore sulla massa cambia 2. Uno dei partner interagenti (ligando di seguito) è immobilizzato su un chip matrice polimerica e la seconda molecola (in seguito analita) è fluita sulla superficie. Analita legame al ligando altera la massa sulla superficie del chip. Questo cambiamento massa è direttamente proporzionale alla variazioni dell'indice di rifrazione della superficie. I risultati sono riportati in tempo reale epresentate come unità di risposta (RU) in funzione del tempo. Tale trama è definita una Sensogramma (es, Figura 1). Poiché SPR segue il decorso completa dell'interazione, pre-equilibrio costanti di velocità cinetica derivano, oltre all'equilibrio affinità. Come descritto di seguito, il comportamento pre-equilibrio di un dato sistema contiene molte informazioni, e fornisce una prospettiva molto diverso equilibrio da solo. Una volta che il sistema è calibrato, esperimenti sono molto veloci e richiedono solo piccole quantità di materiale proteico (microgrammi di nanogrammi importi). Raccolta delle informazioni complete cinetica di un dato sistema può essere realizzato in giorni. L'elevata sensibilità della SPR offre misurazioni che non sono possibili con qualsiasi altra tecnica 6. Tuttavia, questa elevata sensibilità è una 'spada a doppio taglio' dal momento che può essere una fonte importante per i dati falsi positivi. Qualsiasi fattore che influenza l'indice di riflessione viene registrata e tracciata sul Sensogramma. Come tale, apcontrolli propriate devono essere utilizzati per eliminare i falsi positivi, e il sostegno di strategie complementari è altamente consigliato.
La figura 1 illustra la progressione di un esperimento SPR tramite un chip sensore NTA-rivestito. Il Sensogramma nel riquadro A mostra l'iniezione degli ioni nichel sulla matrice NTA (dati unsubtracted), e visualizza i dati BD pannelli dopo aver sottratto il segnale derivato dalla cella controllo negativo. Frecce rosse e blu mostrano inizio dell'iniezione e la fine, rispettivamente. Immobilizzazione del ligando sul chip altera gradualmente la massa fino iniezione è terminata. Il plateau stabile osservata dopo la cessazione di iniezione del ligando riflette l'associazione stabile del ligando alla superficie (Figura 1B, ciclo 2). Una volta che una linea di base stabile si ottiene un buffer viene iniettato il ligando e la cella di riferimento (Figura 1B, ciclo 3) .Questo iniezione serve come 'controllo in bianco ", e saràsottratto durante l'analisi. Dopo l'iniezione, cambiamenti minori sono registrati, riflettendo un flusso di massa attraverso il chip. Quindi in un ciclo separato (Figura 1B, ciclo 4), l'analita viene iniettato; il graduale aumento RU rappresenta l'associazione della analita al ligando. I siti di legame diventano via via occupati fino al raggiungimento dell'equilibrio. Appena finisce l'iniezione, un calo della RU riflette dissociazione del complesso. Da tali sensograms pre-equilibrio e di equilibrio costanti di velocità possono essere derivati (vedi più avanti). La figura 1 illustra l'interazione transitorio tra il legante e analita. Quando l'interazione è più stabile, la diminuzione del livello di IF è più lento, riflettendo una minore k d.
Qui, descriviamo un esperimento SPR per caratterizzare l'interazione tra un trasportatore di membrana (detergente solubilizzato) e il suo partner funzionale suo substrato affine proteina di legame 6,7. Il mod sceltael sistema è un ATP cassette binding (ABC) trasportatore, ModBC-A di Archeaglobus fulgidus. Questo sistema è stato scelto per i suoi risultati altamente riproducibili, elevato rapporto segnale-rumore, e classica 'on / off' i tassi. Inoltre, trasportatori omologhi ABC sono a disposizione per servire come importanti controlli negativi. Il trasportatore, ModBC (ligando A) viene estratto dalla membrana con detersivo, purificata e immobilizzato sul chip. Il suo partner di interagire solubile, ModA, è l'analita. Come ligando controllo negativo, una diversa RbsBC ABC trasportatore viene utilizzato ("ligando B").
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR è un metodo altamente sensibile per studiare le interazioni molecolari, ed è spesso l'unico approccio che fornisce il monitoraggio in tempo reale di transitori (ma importanti) interazioni. Un esempio è l'interazione transitoria qui presentata, che non poteva essere rilevata da un altro metodo (saggi di pull-down, saggi liposomi sedimentazione 6). Inoltre, mentre altri metodi sono limitati all'equilibrio misurazioni (sia quantitativa o qualitativa), SPR è uno dei pochi tecniche che misurano…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
Riferimenti
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
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