Realtidsmålinger membranprotein: Receptor Interactions Brug overfladeplasmonresonans (SPR)
Summary
Overfladeplasmonresonans (SPR) er en etiket-fri fremgangsmåde til påvisning af biomolekylære vekselvirkninger i realtid. Heri en protokol for et membranprotein: er receptorinteraktion eksperiment beskrevet, mens diskutere fordele og ulemper ved teknikken.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
Protein-protein interaktioner (PPI); dannelse og dissociation af protein komplekser, er centrale begivenheder i mange biologiske processer (f.eks, replikation, transkription, translation, signalering, celle-celle kommunikation). Semi-kvantitative undersøgelser af PPI udføres ofte ved hjælp af pull-down eller immunopræcipitation eksperimenter. Imidlertid er disse (og lignende) teknikker begrænset i området affiniteter, der kan måles (lav mikromolær og højere affinitet) på grund af de vasketrin, der er uløseligt forbundet med sådanne teknikker. Sådanne "end-point" teknikker kan ikke identificere forbigående eller lav affinitet interaktioner, der ofte er store biologiske konsekvenser. Desuden er den tidsmæssige opløsning af sådanne tilgange yderst begrænset, normalt størrelsesordener langsommere end satserne for reaktionen. SPR overvinder disse mangler på grund af sin øget følsomhed og overlegen tidsopløsning 1,2. SPR er en etiket-fri metode, og som sådankan måles molekylær interaktion (så længe som det kan påvises masseændringer). Foruden PPI, er det blevet udstrakt anvendt til at karakterisere protein-ligand, protein-lægemiddel (eller lille molekyle), protein-DNA og protein-RNA interaktioner 3-5. Resultaterne registreres og afbildes i realtid, hvilket muliggør hurtig ændring af eksperimentelle betingelser og fleksibel eksperimentelle design.
Det fysiske princip bag SPR instrumenter er udnyttelsen af et optisk system, som måler en ændring i brydningsindekset på sensoroverfladen ved masseændringer 2. En af de interagerende partnere (herefter ligand) immobiliseres på en polymermatrix chip og det andet molekyle (herefter analyt) er strømmet hen over overfladen. Analytbinding til liganden ændrer masse på chip overfladen. Denne masse ændring direkte proportionalt relateret til ændringer i brydningsindeks af overfladen. Resultaterne er afbildet i realtid ogpræsenteres som responsenheder (RU) som en funktion af tid. Et sådant plot betegnes en Sensogrammet (f.eks, figur 1). Da SPR følger den fuldstændige tidsforløbet for interaktion, er præ-ligevægts kinetiske hastighedskonstanter afledt ud til ligevægt tilhørsforhold. Som beskrevet nedenfor, før ligevægt opførsel af et givet system, holder mange oplysninger, og giver en meget anderledes perspektiv end ligevægt alene. Når systemet er kalibreret, eksperimenter er meget hurtigt og kræver kun små mængder protein materiale (mikrogram til nanogram beløb). Indsamling fuldstændig kinetiske oplysninger om et givet system kan opnås i dage. Den høje følsomhed SPR giver målinger, der ikke er muligt ved hjælp af en hvilken som helst anden teknik 6. Men denne høje følsomhed er en "tveægget sværd", da det kan være en stor kilde til falske positive data. Enhver faktor, der påvirker den reflekterende indeks registreres og afbildes på Sensogrammet. Som sådan apaf en hensigtsmæssig kontrol skal anvendes til at eliminere falske-positive, og støtte fra komplementære metoder er meget anbefales.
Figur 1 illustrerer udviklingen af et SPR-eksperiment under anvendelse af en NTA-overtrukne sensor chip. Sensogrammet i panel A viser indsprøjtningen af nikkelioner over NTA matrix (usubtraheret data), og panelerne BD vise dataene efter subtraktion af signalet afledt fra den negative kontrol celle. Rød og blå pile viser injektion start og slut, hhv. Immobilisering af liganden på chippen gradvist ændrer massen indtil injektionen er afsluttet. Den stabile plateau observeret efter afslutning af ligand indsprøjtning afspejler stabil association af liganden til overfladen (figur 1B, cyklus 2). Når en stabil basislinie er opnået en buffer injiceres over liganden og henvisningen celle (figur 1B, cyklus 3) .Dette injektion tjener som en blank kontrol ", og vil væretrækkes under analyse. Ved injektion, registreres mindre ændringer, som afspejler en strøm af masse gennem chippen. Derefter i en separat cyklus (figur 1B, cyklus 4) analytten injiceres; den gradvise stigning i RU repræsenterer analyt associering til liganden. De bindingssteder bliver gradvist besat indtil der er ligevægt. Så snart injektion ender, et fald i jernbanevirksomhederne afspejler kompleksets dissociation. Fra sådanne sensogrammer pre-ligevægts og ligevægt hastighedskonstanterne kan afledes (se senere). Figur 1 viser en forbigående interaktion mellem liganden og analytten. Når samspillet er mere stabil, nedgangen i jernbanevirksomhedsplan er langsommere, hvilket afspejler en lavere k d.
Heri beskriver vi en SPR eksperiment formål at karakterisere vekselvirkningen mellem en membran transporter (detergent solubiliseret) og dens funktionelle partner, dets kognate substratbinding protein 6,7. Den valgte model-systemet er en ATP bindende kassette (ABC) transporter, ModBC-A i Archeaglobus fulgidus. Dette system blev valgt for sin meget reproducerbare resultater, højt signal-støj-forholdet, og klassisk 'on / off' priser. Derudover er tilgængelige til at fungere som vigtige negative kontroller homologer ABC transportører. Transportøren, ModBC (ligand A) ekstraheres fra membranen ved anvendelse af detergent, renset og immobiliseret på chippen. Dens opløselige interagerende partner, Moda, er analysanden. Som en negativ kontrol ligand, er en anden ABC transportør RbsBC anvendes ("ligand B").
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR er en meget følsom metode til at studere molekylære interaktioner, og ofte er den eneste metode, der giver real-time overvågning af forbigående (men vigtige) interaktioner. Et eksempel er den forbigående interaktion præsenteret heri, som ikke kunne påvises ved en anden metode (pull-down assays liposomer sedimentation 6 assays). Desuden, mens andre metoder er begrænset til ligevægt målinger (enten kvantitativt eller kvalitativt), SPR er en af de eneste teknikker, der måler også pre-ligev?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
Riferimenti
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. . Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. . Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
