झिल्ली प्रोटीन की वास्तविक समय की माप: रिसेप्टर सहभागिता सतह plasmon अनुनाद का प्रयोग (एसपीआर)
Summary
सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) वास्तविक समय में जैव आणविक बातचीत का पता लगाने के लिए एक लेबल से मुक्त तरीका है। इस के साथ साथ, एक झिल्ली प्रोटीन के लिए एक प्रोटोकॉल: तकनीक के पेशेवरों और विपक्ष पर चर्चा करते हुए रिसेप्टर बातचीत प्रयोग, वर्णित है।
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई); गठन और प्रोटीन परिसरों की हदबंदी, कई जैविक प्रक्रियाओं (जैसे, प्रतिकृति, प्रतिलेखन, अनुवाद, सिगनल, सेल सेल संचार) में महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं। पल्स पोलियो टीकाकरण के अर्द्ध मात्रात्मक अध्ययन अक्सर पुल से नीचे या इम्युनो-वर्षा प्रयोगों का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, इन (और) भी इसी तरह की तकनीक की वजह से इस तरह की तकनीक के लिए निहित हैं कि कपड़े धोने की सीढ़ियों को मापा जा सकता है कि समानताएं की सीमा (कम micromolar और उच्च आत्मीयता) में सीमित कर रहे हैं। इस तरह के "अंत बिंदु" तकनीक अक्सर महान जैविक परिणाम के हैं कि क्षणिक या कम आत्मीयता बातचीत की पहचान नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, इस तरह के दृष्टिकोण का अस्थायी समाधान अत्यंत, प्रतिक्रिया की दरों की तुलना में धीमी परिमाण के आम तौर पर आदेश के लिए सीमित है। एसपीआर इसकी वजह से बढ़ संवेदनशीलता और बेहतर अस्थायी समाधान 1,2 करने के लिए इन कमियों पर काबू। एसपीआर जैसे और, एक लेबल से मुक्त विधि है(मास परिवर्तन का पता लगाया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में) आणविक बातचीत मापा जा सकता है। पल्स पोलियो टीकाकरण के अलावा, यह बड़े पैमाने पर प्रोटीन ligand, प्रोटीन-दवा (या छोटे अणु), प्रोटीन डीएनए और प्रोटीन-शाही सेना बातचीत 3-5 चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। परिणाम दर्ज की गई और प्रयोगात्मक शर्तों और लचीला प्रयोगात्मक डिजाइन का तेजी से संशोधन सक्षम बनाता है जो वास्तविक समय में प्लॉट किए जाते हैं।
एसपीआर आधारित उपकरणों के पीछे भौतिक सिद्धांत बड़े पैमाने पर 2 परिवर्तन पर सेंसर की सतह पर अपवर्तक सूचकांक का एक परिवर्तन उपाय है कि एक ऑप्टिकल प्रणाली का उपयोग होता है। बातचीत भागीदारों (इसके बाद ligand) में से एक एक बहुलक मैट्रिक्स चिप और दूसरा अणु (इसके बाद विश्लेष्य) सतह पर प्रवाहित होती है पर स्थिर है। Analyte ligand के लिए बाध्य चिप सतह पर बड़े पैमाने बदल। यह बड़े पैमाने पर परिवर्तन सीधे और आनुपातिक सतह का अपवर्तनांक में परिवर्तन से संबंधित है। परिणामों को वास्तविक समय में प्लॉट किए जाते हैं औरसमय के एक समारोह के रूप में प्रतिक्रिया इकाइयों (आरयू) के रूप में प्रस्तुत किया। इस तरह के एक भूखंड एक sensogram में कहा जाता है (उदाहरण के लिए, चित्रा 1)। एसपीआर बातचीत का पूरा समय पाठ्यक्रम इस प्रकार है के बाद से, पूर्व संतुलन गतिज दर स्थिरांक समानताएं संतुलन के अलावा, निकाली गई है। नीचे विस्तृत रूप में, एक दिया प्रणाली के पूर्व संतुलन व्यवहार ज्यादा जानकारी रखती है, और अकेले संतुलन की तुलना में एक बहुत अलग परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है। प्रणाली calibrated है एक बार, प्रयोगों बहुत तेजी से कर रहे हैं और (मात्रा nanogram को माइक्रोग्राम) प्रोटीन सामग्री की ही छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है। एक दिया प्रणाली की पूरी गतिज जानकारी एकत्रित दिनों में प्राप्त किया जा सकता है। एसपीआर की उच्च संवेदनशीलता किसी भी अन्य तकनीक 6 का प्रयोग संभव नहीं है कि माप देता है। हालांकि, इस उच्च संवेदनशीलता यह झूठी सकारात्मक डेटा के लिए एक प्रमुख स्रोत हो सकता है के बाद से एक 'दोधारी तलवार' है। चिंतनशील सूचकांक को प्रभावित करता है कि किसी भी कारक दर्ज की गई और sensogram पर साजिश रची है। इस तरह, एपी के रूप मेंpropriate नियंत्रण झूठी सकारात्मक खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और पूरक दृष्टिकोण से समर्थन अत्यधिक की सलाह दी है।
चित्रा 1 एक NTA लेपित सेंसर चिप का उपयोग कर एक एसपीआर प्रयोग की प्रगति को दिखाता है। पैनल में sensogram NTA के मैट्रिक्स के ऊपर निकल आयनों (unsubtracted डेटा) के इंजेक्शन से पता चलता है, और पैनलों बी.डी. नकारात्मक नियंत्रण सेल से ली गई संकेत घटाने के बाद डेटा प्रदर्शित करते हैं। लाल और नीले तीर क्रमशः, इंजेक्शन शुरू और अंत दिखा। इंजेक्शन समाप्त होता है जब तक चिप पर ligand के स्थिरीकरण धीरे-धीरे बड़े पैमाने बदल। ligand के इंजेक्शन की समाप्ति के बाद मनाया स्थिर पठार सतह (चित्रा 1 बी, चक्र 2) के लिए ligand के स्थिर एसोसिएशन को दर्शाता है। एक स्थिर आधारभूत हासिल की है एक बार एक बफर ligand और है इस इंजेक्शन एक 'खाली नियंत्रण "के रूप में कार्य करता संदर्भ सेल (चक्र 3 चित्रा 1 बी,) पर इंजेक्ट किया जाता है, और हो जाएगाविश्लेषण के दौरान घटाया। इंजेक्शन पर, मामूली परिवर्तन चिप के माध्यम से बड़े पैमाने पर की एक प्रवाह को दर्शाती दर्ज हैं। तो एक अलग चक्र (चित्रा 1 बी, चक्र 4) में, विश्लेष्य इंजेक्ट किया जाता है; आरयू में क्रमिक वृद्धि ligand के लिए विश्लेष्य एसोसिएशन का प्रतिनिधित्व करता है। संतुलन तक पहुँच जाता है जब तक बाध्यकारी साइटों धीरे-धीरे कब्जा कर लिया हो। जैसे ही इंजेक्शन समाप्त हो जाती है, के रूप में रस में गिरावट जटिल की हदबंदी को दर्शाता है। पूर्व संतुलन और संतुलन दर स्थिरांक प्राप्त किया जा सकता है इस तरह के sensograms से। (बाद में देखें) एक ligand और विश्लेष्य के बीच एक क्षणिक बातचीत दर्शाया गया चित्र। बातचीत और अधिक स्थिर हो गया है, आरयू स्तर में गिरावट के लिए एक कम कश्मीर डी को दर्शाती है, धीमी है।
इस के साथ साथ, हम अपने आत्मीय सब्सट्रेट प्रोटीन 6,7 बाध्यकारी एक झिल्ली ट्रांसपोर्टर (डिटर्जेंट solubilized) और उसके कार्यात्मक साथी के बीच बातचीत निस्र्पक करने के उद्देश्य से एक एसपीआर प्रयोग का वर्णन है। चुना आधुनिक विपणनएल प्रणाली एक एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर, Archeaglobus fulgidus की ModBC-ए है। इस प्रणाली दरों '/ बंद', इसकी अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत चयनित है, और शास्त्रीय गया था। इसके अतिरिक्त, homologues एबीसी ट्रांसपोर्टरों के रूप में महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण की सेवा के लिए उपलब्ध हैं। ट्रांसपोर्टर, ModBC (ligand के ए) डिटर्जेंट, शुद्ध और चिप पर स्थिर का उपयोग कर झिल्ली से निकाला जाता है। इसके घुलनशील बातचीत साथी, मोडा, विश्लेष्य है। एक नकारात्मक नियंत्रण ligand के रूप में, एक अलग एबीसी ट्रांसपोर्टर RbsBC ("ligand के बी ') का इस्तेमाल किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एसपीआर आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक बेहद संवेदनशील तरीका है, और क्षणिक (अभी तक) महत्वपूर्ण बातचीत की वास्तविक समय की निगरानी प्रदान करता है कि केवल दृष्टिकोण अक्सर है। एक उदाहरण किसी अन्य विधि…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
Riferimenti
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