Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de l'urine cellules dérivées
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
Cardiomyopathie dystrophique est une conséquence mal compris de la dystrophie musculaire. Générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP) provenant de patients atteints de dystrophie musculaire est une source précieuse cellulaire pour des systèmes de modèles in vitro de la maladie à l'intérieur et peut être utilisé pour des études de criblage de médicaments. Les cellules d'urine provenant de patients ont été utilisés dans une reprogrammation réussie dans les cellules souches pluripotentes induites afin de modéliser une cardiomyopathie dystrophique. Répondre aux préoccupations de l'intégration des systèmes de vecteurs de sécurité, nous présentons un protocole utilisant un vecteur de virus Sendai non-intégration pour la transduction de Yamanaka facteurs dans les cellules d'urine prélevés chez des patients atteints de dystrophie musculaire. Ce protocole génère entièrement reprogrammé clones dans les 2-3 semaines. Les cellules pluripotentes sont indemne de vecteurs par passage-13. Ces CSPi dystrophiques peuvent être différenciées en cardiomyocytes et utilisés soit pour étudier les mécanismes de la maladie ou pour le dépistage de la drogue.
Introduction
La cardiomyopathie est la deuxième principale cause de décès chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne et de Becker (MD). Bien que des mutations dans le gène de la dystrophine liée à l'X se produisent dans une: 3500 naissances masculines, on sait très peu sur les événements moléculaires et cellulaires conduisant à une dégradation progressive du muscle cardiaque. cellules souches pluripotentes humaines induites provenant de patients atteints de dystrophie musculaire ont émergé comme un nouvel outil pour étudier les mécanismes de la maladie sous-jacents et à utiliser pour le dépistage de drogues 1,2.
Le malaise prévue de biopsies de la peau ou des échantillons de sang peut dissuader les jeunes patients et / ou leurs tuteurs de donner son consentement pour la participation à l'étude. Les échantillons d'urine sont une source non invasive de cellules somatiques qui sont amendable des procédés de reprogrammation. Nous avons récemment montré que les cellules d'urine prélevés de patients atteints de dystrophie musculaire peuvent être cultivées et efficacement reprogrammé en utilisant CSPi transduction rétrovirale avec les facteurs Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, et c-Myc; OSKM) 1. L'inconvénient de délivrance de gène rétroviral est l'intégration aléatoire de gènes de reprogrammation dans les chromosomes de l'hôte. Pour surmonter cette limitation, nous avons utilisé le virus Sendai non-intégration pour la reprogrammation des cellules d'urine.
Ce protocole détaille le virus Sendai reprogrammation des cellules isolées urine de patients atteints de dystrophie musculaire qui peut ensuite être différenciées en cardiomyocytes ou d'autres types de cellules pour une étude plus approfondie. Ce protocole peut également être adapté à d'autres maladies spécifiques des patients.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modélisation des maladies cardiovasculaires à l'aide CSPi devient une approche commune pour comprendre la contribution génétique 4-6. Certaines difficultés imprévues d'obtenir des échantillons de cellules de patients, en particulier les jeunes enfants, peuvent être évités en offrant la possibilité d'une approche non invasive comme une collection d'urine. Dans cette jeune population de patients, il est souvent difficile de recueillir un volume d'urine suffisante pour produire des…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
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