근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
이영 심근 병증은 근육 이영양증 제대로 이해 결과이다. 근이영양증 환자에서 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하면 체외 질병 모델 시스템을위한 귀중한 셀룰러 소스 및 약물 검사 연구에 사용할 수 있습니다. 환자 뇨 – 유래 세포는 1 이영양증 심근증을 모델링하기 위해 유도 된 다 능성 줄기 세포로의 성공적인 리 프로그래밍에 사용되어왔다. 벡터 시스템을 통합의 안전성 문제를 해결하는, 우리는 야마나카의 전달은 근이영양증 환자로부터 수집 된 소변 세포에 인자 비 통합 센다이 바이러스 벡터를 이용하여 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 완전히 2-3주 내에서 클론을 재 프로그램 생성합니다. 만능 세포 통로 (13)에 의해 벡터 무료입니다. 이 이영 iPSCs는 심근 세포로 분화 및 질병 메커니즘 또는 약물 검사에 대한 공부를 사용할 수있다.
Introduction
심근증은 뒤 시엔 느와 베커 근이영양증 (MD) 환자에서 두 번째로 높은 사망 원인이다. X-연결 디스트로핀 유전자의 돌연변이가 하나 발생하더라도 3,500 남성 출산, 약간은 진보적 인 심장 근육 손상을 유도하는 분자 및 세포 이벤트에 대한 알려져있다. 근이영양증 환자 유래의 인간 유도 다 능성 줄기 세포는 기저 질환 메커니즘을 연구 약물 1,2- 스크리닝에 사용하는 신규 한 도구로 나왔다.
피부 조직 검사 또는 혈액 샘플의 예상되는 불편 함은 연구 참여에 대한 동의를하는 젊은 환자 및 / 또는 보호자를 설득 할 수 있습니다. 소변 샘플은 리 프로그래밍을 수정할 수있는 방법이다 체세포 비 침습적 원천이다. 우리는 최근 근이영양증 환자로부터 수집 된 소변 세포를 배양 할 수 있다는 것을 도시하고 효율적 야마나카 인자를 사용하여 레트로 바이러스 형질 도입 iPSCs (내로 재 프로그램 한OCT3 / 4, SOX2, Klf4 및 c-Myc와; OSKM) 1. 레트로 바이러스 유전자 전달의 단점은 숙주 염색체로 유전자의 재 프로그래밍 랜덤 통합이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 소변 세포 리 프로그래밍에 대한 비 통합 센다이 바이러스를 사용 하였다.
이 프로토콜은 추가 연구를위한 심근 세포 또는 다른 종류의 세포로 분화 할 수 근이영양증 환자의 격리 소변 세포의 센다이 바이러스의 재 프로그래밍에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 특정 환자 다른 질환을 위해 더 적응 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSCs를 사용하여 심혈관 질환을 모델링하는 것은 유전 적 기여 4-6를 이해하는 일반적인 방법이되고있다. 환자 세포로부터 샘플을 얻는 몇몇 예상치 못한 문제, 특히 어린 아이들, 이러한 소변 수집 같이 비 침습적 접근하는 옵션을 제공함으로써 회피 할 수있다. 이 젊은 환자 집단에서, 재 프로그래밍을위한 충분한 세포 소변을 수득하기에 충분한 양의 소변을 수집하는 것이 곤란하다. 유?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
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