Summary
هنا، نحن تصف بروتوكول لتخليق الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic مع لحظة مغناطيسية قوية والأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد) الامتصاصية قوي. ويشمل البروتوكول أيضا الأجسام المضادة الاقتران إلى النانوية من خلال شاردة التيسير لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية التي تتطلب استهداف محدد الجزيئي.
Abstract
الخواص المغناطيسية وplasmonic مجتمعة في جسيمات متناهية الصغر واحدة توفر التعاون الذي هو مفيد في عدد من التطبيقات الطبية الحيوية بما في ذلك تعزيز التباين في طرائق التصوير magnetomotive جديدة، القبض في وقت واحد وكشف تعميم الخلايا السرطانية (CTCs)، والتصوير الجزيئي المتعدد الوسائط جنبا إلى جنب مع العلاج حراري ضوئي؛ ضوحراري الخلايا السرطانية. وقد حفزت هذه التطبيقات اهتماما كبيرا في تطوير بروتوكولات لتخليق الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic مع الامتصاصية الضوئية في الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد) والمنطقة لحظة مغناطيسية قوية. هنا، نقدم بروتوكولا جديدا لتوليف هذه الجسيمات النانوية الهجينة التي تعتمد على طريقة microemulsion النفط في المياه. ميزة فريدة من بروتوكول الموصوفة هنا هي تجميع الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic من مختلف الأحجام من كتل الأولية التي لديها أيضا خصائص مغناطيسي، plasmonic. هذا النهج غلة النانوية مع دن عاليةSITY من الوظائف المغناطيسية وplasmonic التي تتوزع بشكل موحد في جميع أنحاء حجم جسيمات متناهية الصغر. النانوية المختلطة بين functionalized يمكن بسهولة عن طريق ربط الأجسام المضادة من خلال شاردة التيسير وترك جزء فاب هي المسؤولة عن مستضد ملزمة متاح للاستهداف.
Introduction
يمكن النانوية المختلطة التي تتكون من مواد مختلفة مع خصائص الفيزيائية متميزة فتح فرص جديدة في التطبيقات الطبية الحيوية بما في ذلك التصوير الجزيئي المتعدد الوسائط، والتسليم العلاج والرصد والفحص جديد وفحوصات تشخيصية 1-3. مزيج من خصائص plasmonic والمغناطيسية في جسيمات متناهية الصغر وحيدة هي ذات أهمية خاصة لأنه يوفر قوية جدا تشتت الضوء وامتصاص عبر الفروع المرتبطة الأصداء مأكل والاستجابة لمجال مغناطيسي. على سبيل المثال، تم استخدام الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic لزيادة التباين في التصوير الحقل المظلم من الخلايا المسمى من خلال تطبيق تعديل إشارة الزمني عبر مغناطيس كهربائي خارجي 3-5. وفي الآونة الأخيرة، تم تطبيق مبدأ مماثل في تطوير طريقة التصوير الجديدة - التصوير الضوئي مغناطيسي، حيث تمكن الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic تحسينات كبيرة في التباين والفئران إشارة إلى الخلفيةIO 6،7. وقد تبين أيضا أن جزيئات هجينة يمكن استخدامها لالتقاط وكشف عن الخلايا السرطانية المنتشرة في الدم الكامل والحية 8،9 في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic واعدة وكلاء theranostic والتي يمكن استخدامها لالجزيئي التصوير الضوئي وMR محددة جنبا إلى جنب مع العلاج حراري ضوئي؛ ضوحراري الخلايا السرطانية 10.
تم استكشاف عدة طرق لتخليق الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic. على سبيل المثال، يو وآخرون. تحلل وتستخدم أكسدة الحديد (CO) 5 على جزيئات الذهب لتشكيل مثل الدمبل bifunctional الاتحاد الافريقي الحديد 3 O 4 النانوية 11. وانغ وآخرون. وتوليفها المغلفة الذهب أكسيد الحديد جسيمات متناهية الصغر باستخدام طريقة التحلل الحراري 12. بعض المناهج الأخرى تعتمد على طلاء البوليمر أو أمين الجزيئات النانوية الوظيفية على جوهر المغناطيسية تليها ترسب AGقذيفة قديمة على سطح البوليمر لخلق هجين جسيمات 7،13. بالإضافة إلى ذلك، كانت تعلق جزيئات أكسيد الحديد لنانواعواد الذهب عن طريق التفاعلات كهرباء أو تفاعل كيميائي 14،15. على الرغم من أن هذه النهج تسفر النانو مغناطيسي، plasmonic، أنها تنازلات لبعض الخصائص مدى مزيج مغناطيسي plasmonic مثل الامتصاصية الضوئية في الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد) نافذة أو لحظة المغناطيسية القوية وكلاهما مرغوب فيه للغاية في التطبيقات الطبية الحيوية. على سبيل المثال، الاتحاد الافريقي الدمبل، الحديد 3 O 4 النانوية لها صدى مأكل الذروة في 520 نانومتر مما يحد من فائدتها في الجسم الحي بسبب تعكر النسيج عالية في هذا النطاق الطيفي. وعلاوة على ذلك، فإن الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic التي تنتجها البروتوكولات الحالية تقتصر على واحدة فقط 11 أو قليلة (أقل من 10) 14،15 الأنصاف مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic (مثل جزيئات أكسيد الحديد) التي هي أقل بكثير مما يمكن أن يكون منظمة العمل ضد الجوعieved في البنية النانوية المزدحمة بالسكان. على سبيل المثال، يمكن أن تحتوي على المكتظ 60 نانومتر قطر جسيمات متناهية الصغر كروية بناء على أمر من ألف من 6 جزيئات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic نانومتر. وبالتالي، هناك غرفة كبيرة لتحسين الخواص المغناطيسية للجزيئات هجينة. وعلاوة على ذلك، بعض البروتوكولات التي سبق وصفها معقدة نسبيا وتتطلب حذرا الأمثل من أجل تجنب تجميع الجسيمات خلال التوليف 14،15.
هنا، نحن تصف بروتوكول لتخليق الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic مع لحظة مغناطيسية قوية والامتصاصية الجرد الوطني القوي الذي يعالج القيود الرئيسية من الفن الحالي. تركيب جذوره في النفط في مياه طريقة microemulsion 16. لأنه يقوم على تجميع جزيئات من الحجم المطلوب من الجسيمات الأولية أصغر من ذلك بكثير. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لإنتاج النانو من مادة واحدة مثل الذهب، وأكسيد الحديد، والحزب الثوري المؤسسي أشباه الموصلاتماري الجسيمات 16. نحن تمديده لتركيب الجسيمات النانوية الممغنطة بواسطة plasmonic، أولا، مما يجعل قطرها 6 نانومتر الذهب قذيفة / جسيمات أكسيد الحديد الأساسية و، ثم، وتجميع الجسيمات الأولية المختلطة في البنية النانوية كروية النهائية. تجميع الجسيمات الأولية إلى nanoclusters لا يسمح تعزيز خصائص الجسيمات النانوية المكونة، مثل تحقيق لحظة المغناطيسية أقوى مع الحفاظ على خصائص مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic، ولكن أيضا يستفيد من التفاعلات بين الجسيمات النانوية الفردية وبالتالي خلق خصائص جديدة غائبة عن الجسيمات النانوية المكونة، مثل قوية الامتصاصية البصرية في إطار الجرد الوطني. هذا البروتوكول ينتج جزيئات هجينة ذات الكثافة العالية من الوظائف المغناطيسية وplasmonic. بعد synthetized الجسيمات الأولية، أسلوبنا هو في الأساس رد فعل بسيط وعاء واحد. يتم تحديد قوة مأكل صدى الشاملة والعزم المغناطيسي من قبل عدد من الجسيمات الأولية و، ذرefore، يمكن أن يكون الأمثل بسهولة اعتمادا على التطبيق. وعلاوة على ذلك، كما قمنا بتطوير إجراء لتصريف الأجسام المضادة لالنانوية الهجينة لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية التي تتطلب استهداف محدد الجزيئي. وتعلق الأجسام المضادة من خلال شاردة التيسير وترك جزء فاب هي المسؤولة عن مستضد ملزمة متاح للاستهداف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. أدوات القياس وإعداد زجاجيات
- ارتداء معدات الحماية المناسبة، أي معطف المختبر، والقفازات القابل للتصرف، وحماية العين.
- توصيل قارورة جولة القاع إلى مكثف وتزج به في حمام زيت السيليكون مع رصد درجات الحرارة بواسطة مقياس الحرارة. وضع مصدر للحرارة (على سبيل المثال، لوحة الساخنة) تحت حمام الزيت (الشكل 1). استخدام مقياس الحرارة قادر على قياس درجة حرارة أعلى من 260 درجة مئوية.
النانوية 2. توليف الهجين الابتدائي مغناطيسي plasmonic
- جعل الجسيمات النانوية المغناطيسية الأساسية
- إضافة 353.2 ملغ (1 ملمول) الحديد (III) acetylacetonate، 1 مل (2 ملمول) حامض الأوليك، 1 مل (2 ملمول) oleylamine، 1.292 غرام (5 ملمول) 1،2-hexadecanediol، و 10 مل الأثير فينيل لجولة قارورة القاع.
- يقلب الخليط باستخدام بقوة المغناطيسي ضجة بار والحرارة إلى 250-260 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تحت التكثيف. ثم، انتظر حل لتبريدوصولا الى RT. ضمان درجة الحرارة تحت 260 درجة مئوية لمنع غليان الأثير فينيل ومنع انفجار خليط التفاعل من القارورة ذهابا وأسفل إلى المكثف.
تنبيه: خليط التفاعل حار للغاية ويمكن أن يسبب تهيج المواد الكيميائية. يجب أن تعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. ضمان التهوية الكافية لحمام الزيت.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ حمام الزيت في درجة حرارة 250-260 درجة مئوية لمدة 1 ساعة خلال توليف النانوية المغناطيسية. من حيث المبدأ، طبق زجاج بيركس يمكن استخدامها لهذا الغرض. ومع ذلك، وأقصى درجة حرارة مستمرة للزجاج بيركس هي ~ 260 درجة مئوية وفقا للمعلومات البائع. وبالتالي، توفر حاوية معدنية خيار أكثر أمانا للتفاعل لأنها يمكن أن تحمل درجة حرارة أعلى وتستمر لفترة أطول أثناء أشواط متعددة.
- ترسب قذيفة على الذهب النانوية المغناطيسية الأساسية
- إضافة 411.5 ملغم (1.1 ملمول) الآس الذهبتيت، 0.25 مل (0.75 ملمول) حامض الأوليك، 1.5 مل (3.0 ملمول) oleylamine، 775.3 ملغ (3 ملمول) 1،2-hexadecanediol، و 15 مل فينيل الأثير إلى قارورة جولة القاع.
- إضافة 5 مل تعليق الجسيمات النانوية المغناطيسية من الخطوة 2.1. تسخين خليط التفاعل إلى 180 درجة مئوية، وتبقى تحت التكثيف لمدة 1 ساعة. انتظر الحل لتهدئة لRT.
- إضافة 50 مل من الإيثانول لترسيب الجسيمات النانوية الابتدائية المختلطة تليها الطرد المركزي في 3،250 × ز لمدة 15 دقيقة.
- Resuspend وراسب في 25 مل الهكسان باستخدام sonicator حمام. إضافة 25 مل من الإيثانول لترسيب جزيئات هجينة الأولية. أجهزة الطرد المركزي في 3،250 x ج لمدة 15 دقيقة و resuspend راسب في الهكسان. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- تجفيف النانوية الهجين الأساسي عجلت في فراغ مجفف O / N. تأكد من أن الجزيئات جافة تماما.
Nanoclusters 3. الهجين مغناطيسي plasmonic التجميعي والحجم الفصل
- إضافة محلول من الخطوة 3،1 حتي 10 مل من محلول مائي من كبريتات الصوديوم دوديسيل (2.8 ملغ / مل) في كوب قارورة 20 مل مع قبعات المرفقة. إضافة تعليق الأساسي قطرة قطرة النانوية الهجينة لتجنب اختلاط المرحلتين قبل الخطوة التالية.
- يصوتن الحل على مرحلتين في sonicator الحمام لمدة 2 ساعة، يليها التدفئة في حمام مائي عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. انتظر الحل لتهدئة لRT.
- ملء المياه إلى خط مستوى التشغيل للحمام صوتنة. توسيط قارورة زجاجية في الحمام صوتنة. وأشكال مستحلب مباشرة بين المرحلتين. يهز الحل على مرحلتين باليد بعد بداية صوتنة. هذا يسهل الخلط بين مرحلة تحتوي على الجسيمات النانوية المختلطة الابتدائية والمرحلة المائية السفلية.
ملاحظة: كن على علم ثار sonicator سوف تسخن بعد 2 ساعة من العملية.
- ملء المياه إلى خط مستوى التشغيل للحمام صوتنة. توسيط قارورة زجاجية في الحمام صوتنة. وأشكال مستحلب مباشرة بين المرحلتين. يهز الحل على مرحلتين باليد بعد بداية صوتنة. هذا يسهل الخلط بين مرحلة تحتوي على الجسيمات النانوية المختلطة الابتدائية والمرحلة المائية السفلية.
- الطرد المركزي تعليق nanocluster الهجين في 100 x ج لمدة 30 دقيقة. جمع كل من راسب وطاف. Resuspend وراسب في 0.1 ملي سيترات الصوديوم أقل من 10 دقيقة صوتنة. الحجم المتوقع من nanoclusters هو ~ 180 نانومتر في القطر.
- نقل طاف من الخطوة 3.3 إلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
- الطرد المركزي تعليق من الخطوة 3.4 في 400 x ج لمدة 30 دقيقة. جمع كل من راسب وطاف. Resuspend وراسب في 0.1 ملي سيترات الصوديوم أقل من 10 دقيقة صوتنة. الحجم المتوقع من nanoclusters هو ~ 130 نانومتر في القطر.
- نقل طاف من الخطوة 3.5 إلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
- الطرد المركزي تعليق من الخطوة 3.6 في 1،500 x ج لمدة 30 دقيقة. جمع راسب وresuspend في 0.1 ملي سيترات الصوديوم أقل من 10 دقيقة صوتنة. الحجم المتوقع من nanoclusters هو ~ 90 نانومتر في القطر.
- إضافة 300 _6؛ ل nanocluster تعليق لقارئ صفيحة ميكروسكوبية 96 جيدا لقياس طيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس-الجرد الوطني. إسقاط 10 ميكرولتر nanocluster تعليق على الشبكة النحاسية المغلفة الكربون لTEM التصوير.
4. الإقتران من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إلى Nanoclusters
- إعداد 100 ميكرولتر حل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (1 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، على سبيل المثال، المضادة للمستقبلات عامل نمو البشرة 2 (HER2) الأجسام المضادة أو مكافحة البشرة مستقبلات عامل النمو 1 (EGFR) الأجسام المضادة.
- إضافة محلول الأجسام المضادة من الخطوة 4،1-3،9 مل 4 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.2. الطرد المركزي الحل من خلال 10 ك MWCO فلتر الطرد المركزي في 3،250 x ج لمدة 20 دقيقة على 8 ° C. Resuspend والأجسام المضادة في 4 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.2، إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة إلى استبدال وسائل الاعلام الأصلي في حل الأجسام المضادة مع HEPES. - إضافة 10 ميكرولتر من 100 ملي NaIO 4-100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة. تغطية قارورة رد فعل مع آلاحباط uminum على RT وتخلط لمدة 30 دقيقة باستخدام شاكر المداري.
- إخماد رد فعل من خلال إضافة 500 ميكرولتر من 1X PBS.
- إضافة 2 ميكرولتر من 46.5 ملي حل رابط (dithiolaromatic PEG6 CONHNH-2) إلى حل الأجسام المضادة من الخطوة 4.4 ويهز لمدة 1 ساعة على RT.
- تصفية الحل باستخدام فلتر الطرد المركزي 10 ك MWCO في 3،250 x ج لمدة 20 دقيقة على 8 ° C. Resuspend والأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني 1X إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر الأمر الذي يؤدي إلى تركيز الأجسام المضادة من ~ 1 ملغ / مل.
- مزيج 100 ميكرولتر nanocluster تعليق على OD ~ 1.0 مع 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة تعديل خطوة 4.6 (1 ملغ / مل) لمدة 120 دقيقة في RT.
- إضافة 10 ميكرولتر من 10 -3 M 5 كيلو دالتون ثيول PEG ويهز لمدة 15 دقيقة في RT.
- الحل الطرد المركزي في ز × 830 لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف و resuspend الرواسب في 100 ميكرولتر 2٪ ث / ت 5 كيلو دالتون PEG في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2.
- قياس طيف الامتصاص للnanoclusters الأجسام المضادة مترافق ومقارنة رانه الامتصاصية طيف nanoclusters العارية. نتوقع بضعة نانومتر التحول الأحمر بعد الاقتران.
- إذا النانوية الكلي كما يتضح من تحول كبير مع زيادة في التطوير التنظيمي في المنطقة الحمراء الجرد الوطني، وزيادة تركيز PEG ثيول إلى 5 × 10 -3 م. أيضا، زيادة فترة حضانة مع ثيول PEG إلى 30 دقيقة وتقليل سرعة الطرد المركزي في 200 x ج الزيادات.
- اختبار للكشف عن سرطان وسم الخلية، إضافة الأجسام المضادة مترافق النانوية من الخطوة 4.9 توقف الخلايا السرطانية في إما متوسطة أو برنامج تلفزيوني 1X (1 مل ~ 10 6 خلايا) وتخلط لمدة 60 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مخطط لتوليف immunotargeted nanoclusters مغناطيسي plasmonic في الشكل 2. أولا، synthetized المغناطيسية الحديد 3 O 4 جزيئات أكسيد الحديد عبر طريقة التحلل الحراري. ثم، وتودع رقيقة حوالي 1 نانومتر الذهب قذيفة على جسيمات أكسيد الحديد الأساسية عن طريق التحلل الحراري. النانوية الهجينة الأساسي حوالي 6 نانومتر بمثابة بذور لخلق nanoclusters مغناطيسي plasmonic عن طريق استخدام نهج microemulsion النفط في المياه. وبين functionalized وnanoclusters مع الاجسام المضادة لاستهداف محدد الجزيئي.
حجم الحديد وتصنيعه-النانوية أكسيد الأساسية هي ~ 5 نانومتر في القطر. بعد ترسب الذهب قذيفة على جوهر المغناطيسي، وحجم الحديد الرئيسي أكسيد الأساسية / الذهب قذيفة النانوية الزيادات إلى ~ 6 نانومتر في القطر. يتغير لون الغروية من البني للجزيئات أكسيد الحديد الأحمر إلى الأرجواني بعد ترسب من الذهب وقذيفة،أخيرا، إلى اللون الأرجواني والرمادي بعد تجميع الجسيمات الأولية إلى ~ 180 نانومتر قطر nanoclusters كروية (الشكل 3). تظهر الأشعة فوق البنفسجية فيس الأطياف التي / الذهب قذيفة النانوية أكسيد الحديد الأولية الأساسية لها صدى ذروة المميزة في 530 نانومتر غير موجودة في جزيئات أكسيد الحديد العارية (الشكل 4). على تشكيل الكتلة الطيف يتغير بشكل ملحوظ ويسلك الامتصاصية NIR واسع قوي (الشكل 4).
ومترافق على nanoclusters مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة خصيصا لاستهداف الجزيئات الحيوية من الفائدة. بروتوكول يستخدم لتصريف heterofunctional البولي ايثيلين جلايكول (PEG) رابط التي يعلقها المنطقة التيسير من الأجسام المضادة للسطح nanocluster. واحدة من نهاية رابط لديها شاردة هيدرازيد التي تتفاعل مع الجسم المضاد أكسدة الغليكوزيلاتي شاردة. على الطرف الآخر من رابط يحتوي على مجموعة دى ثيول التي لها قابلية قوية إلى السطح من الذهب nanoclusters. لdemonstratالبريد الاستهداف الجزيئي اخترنا إيجابي على سرطان الجلد خط EGFR الخلية (A-431) والإيجابي خط خلايا سرطان الثدي HER2 (SK-BR-3). وبين functionalized Nanoclusters مع أي مكافحة EGFR أو أجسام مضادة للHER2 تليها الاختلاط مع A-431 الخلايا أو SK-BR-3 السرطان، على التوالي. في الشكل 5، لون الذهب مشرق البرتقال على A-431 و SK-BR-3 خلايا السرطان الجزيئي يشير محددة ملزمة من nanoclusters إلى المستقبلات على الخلايا السرطانية المقابلة. في المقابل، لم nanoclusters مضاد للفيروسات غير مستهدفة لا يتفاعل مع الخلايا السرطانية. وتشير هذه النتائج خصوصية الجزيئية للnanoclusters بين functionalized.
الشكل 1. الإعداد التجريبية لتوليف أكسيد الحديد النانوية الأساسية / الذهب قذيفة الأولية. تم توصيل قارورة جولة القاع إلى مكثف. رد الفعل ونفذت في حمام الزيت تحت مراقبة درجة الحرارة بواسطة ميزان حرارة.
الرقم 2. التخطيطي يوضح الخطوات الرئيسية في توليف immunotargeted nanoclusters مغناطيسي plasmonic. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. الصور TEM ولون تعليق الغروية النانوية: (اليسار) أكسيد الحديد النانوية الأساسية؛ (الأوسط) جزيئات أكسيد الحديد المطلي بالذهب. nanoclusters (يمين) الهجين مغناطيسي، plasmonic. شريط النطاق للصور TEM هو 50 نانومتر. ملاحظة: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. (A)-UV-فيس أطياف الجرد الوطني النانوية أكسيد الحديد الأساسية (الأزرق)، وأكسيد الحديد النانوية المغلفة الذهب (الأخضر)، والهجين مغناطيسي plasmonic nanoclusters (الحمراء). (B)-UV-فيس أطياف الجرد الوطني من nanoclusters مغناطيسي plasmonic الهجينة مع مختلف الأحجام: 90 نانومتر (الأزرق) و 130 نانومتر (الأخضر)، و180 نانومتر (أحمر). جميع الأطياف هي تطبيع واحدة على أقصى الامتصاصية لإظهار الاختلافات في التشكيلات الطيفية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. عنخ "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. خصوصية الجزيئية من الأجسام المضادة مترافق مغناطيسي plasmonic nanoclusters: (اليسار) EGFR يعبرون عن A-431 خلايا سرطان الجلد حضنت مع nanoclusters المستهدفة EGFR. (الأوسط) HER2 معربا عن خلايا سرطان الثدي SK-BR-3 حضنت مع nanoclusters التي تستهدف HER2. (يمين) A-431 الخلايا المحتضنة مع nanoclusters مضاد للفيروسات غير مستهدفة. اللون الأصفر البرتقالي الخلايا يشير التوسيم الناجح من قبل nanoclusters بين functionalized. لون رمادي مزرق، يناظر تشتت الذاتية من الخلايا. تم الحصول على الصور باستخدام المجهر تستقيم مع الهدف 20X حقل مظلم واكس مصباح الإثارة. شريط النطاق هو 10 ميكرون._blank "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1. يقارن هذا الفيديو استجابة الخلايا السرطانية A-431 المسمى إما النانوية الأولية أو nanoclusters إلى حقل مغناطيسي خارجي. كلا النوعين الجسيمات حيث مترافق مع الأجسام المضادة لمكافحة EGFR استهداف محدد من EGFR (+) خلايا A431. أولا، كانت مليئة أنبوب إيبندورف مع تعليق الخلايا المسمى. ثم، تم وضع مغناطيس بالقرب من أنبوب وحركة خلايا تم تصويرها في كاليفورنيا 10 ملم بعيدا عن المغناطيس. الفيلم على الجهة اليسرى يظهر الخلايا المسمى مع جزيئات الأولية (6 نانومتر في القطر) والفيلم على الحق - الخلايا المسمى مع nanoclusters مغناطيسي plasmonic (100 نانومتر في القطر). تم الحصول على الأفلام باستخدام مجهر مقلوب في وضع مشرق الميدان مع الهدف 20X. شريط النطاق هو 100 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة في التوليف الناجح للnanoclusters مغناطيسي plasmonic صنع monodispersed عالية الذهب الأساسي قذيفة / الحديد النانوية أكسيد الأساسية وتوجيه التجميع الذاتي للجزيئات الأولية إلى nanoclusters. وهناك نسبة المولي بين الجسيمات الأولية والسطحي تلعب دورا هاما في تحديد حجم التوزيع من nanoclusters. غير موحدة توزيع حجم الجسيمات النانوية الأولية قد يسبب تشكيل المجاميع الكبيرة خلال تجميع nanoclusters مغناطيسي plasmonic. وبالإضافة إلى ذلك، الأسلوب microemulsion تشكيل nanocluster يعتمد على السطحي محبة للجهتين: مجموعات الذيل مسعور عقد النانوية الابتدائية معا والجماعات رأس ماء استقرار nanoclusters في محلول مائي. تركيز السطحي يحدد التجمع nanocluster: ان تركيز عال يؤدي إلى تشكيل nanoclusters أصغر الجسيمات الأولية أو الفردية وتركيز منخفض من شأنه أن يؤدي في الجسيمات التجميع.
الطبقة = "jove_content"> nanoclusters وتوليفها لديها حجم التوزيع واسعة من حوالي 50 نانومتر إلى حوالي 300 نانومتر يتطلب خطوة انفصال إضافية. الطرد المركزي مع سرعة زيادة تدريجيا كما هو موضح في البروتوكول فوق تنتج نتائج جيدة مع الكسور فصل ذات التوزيعات حجم 90 ± 18 نانومتر و 130 نانومتر ± 26، 180 ± 39 نانومتر. يجب أن يكون فصل أدق لانتاج توزيعات أضيق الممكن باستخدام اللوني الحجم الاستبعاد. يجب أن يكون لاحظت أيضا أن nanoclusters لها الامتصاصية واسع في المنطقة الحمراء الجرد الوطني الذي يوفر فرصة لإثارة الأصداء مأكل مع أي مصادر بين حوالي 500 و 900 نانومتر (الشكل 4). ومع ذلك، هذا العقار يحد أيضا انطباق nanoclusters في التصوير المتزامن لأهداف متعددة.
وهناك دائرة نصف قطرها الهيدروديناميكية من nanoclusters الزيادات ~ 10-15 نانومتر الأجسام المضادة بعد الاقتران. هذه الزيادة في القطر يرتبط أهلا وسهلالتر مع حوالي 12 نانومتر من حجم الأجسام المضادة مفتش الحكومة التي يتم تركيبها من خلال شاردة التيسير على سطح الجسيمات النانوية. ولذلك، فإن التغيير في قطر الهيدروديناميكية يتسق مع الكيمياء اقتران اتجاهي الأجسام المضادة من خلال الجزء التيسير التي يتم تنفيذها في البروتوكول. زيتا إمكانات النانوية التحولات من -47.6 بالسيارات الاقتران قبل الأجسام المضادة ل-7.0 بالسيارات بعد الاقتران. تغيير التهمة السطح يوفر أدلة إضافية من الأجسام المضادة لاقتران nanoclusters.
ميزة فريدة من بروتوكول الموصوفة هنا هي تجميع الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic من مختلف الأحجام من كتل الأولية التي لديها أيضا خصائص مغناطيسي، plasmonic. يوفر هذا الأسلوب طريقة بسيطة للسيطرة في وقت واحد قوة من الخصائص plasmonic والمغناطيسية الناتجة من النانو. في المقابل، تستخدم بروتوكولات السابقة لتجميع المواد متناهية الصغر plasmonic والمغناطيسيةق حيث خدم مادة واحدة كنموذج لترسب الآخر واحد؛ في هذا النهج مادة واحدة تحتل حجم والسطح الآخر من النانو الناتجة عن ذلك. الجسيمات النانوية الممغنطة plasmonic ذكرت في الأدب لديهم أقل بكثير كثافة والمبلغ الإجمالي للجسيمات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic بالمقارنة مع nanoclusters أدلى به لدينا بروتوكول 14،15. في أسلوبنا وتوزع الأنصاف المغناطيسية وplasmonic بشكل موحد في جميع أنحاء حجم الهجين مغناطيسي plasmonic النانوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المنح NIH R01 R01 CA103830 EB008101 و.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint | Corning | 4320A-50 | Thermal decomposition reaction |
| PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints | Corning | 2480-300 | Thermal decomposition reaction |
| Silicone oil | Fisher | S159-500 | Oil bath |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-351 | Heat the reacton with stirring function |
| Thermometer | ThermoWorks | 221-092 | Measure temperature |
| Iron(III) acetylacetonate | Fisher | AC11913-0250 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleic acid 99% | Fisher | A195-500 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Gold(III) acetate | Fisher | AA3974206 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Hexane | Fisher | H292-1 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Phenyl ether 99% | Fisher | AC13060-0025 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| 1,2-Hexadecanediol 90% | Sigma | 213748-50G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleylamine 70% | Sigma | O7805-100G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-100 | Cluster synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | W302600 | Cluster synthesis |
| Monoclonal anti-EGF receptor antibody | Sigma | E2156 | Cell labeling specificity test |
| Monoclonal anti-HER2 antibody | Sigma | AMAB90627 | Cell labeling specificity test |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | Oxidate Fc region of antibodies |
| Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2 | SensoPath Technologies | SPT-0014B | Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters |
| Methoxy-PEG-thiol, 5 k | Creative PEGworks | PLS-604 | Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801008 | Protein purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffer |
| PBS, 1x solution | Fisher | BP2438-20 | Buffer |
| UV-Vis spectroscopy | BioTek | Synergy HT | Obtain spectrum |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Separation |
| Transmission Electron Microscope | FEI | TECNAI G2 F20 X-TWIN | Obtain morphology of nanostructures |
| Upright microscope | Leica | DM6000 | Obtain dark-field images |
| Sonicator | Branson | 1510 | Sonication |
| Carbon film 300 mesh grid | EMS | CF300-Cu | TEM imaging |
| 96-well plate | Corning | 09-761-145 | UV-Vis reading plate |
References
- Bigall, N. C., Parak, W. J., Dorfs, D. Fluorescent, magnetic and plasmonic—Hybrid multifunctional colloidal nano objects. Nano Today. 7, 282-296 (2012).
- Gautier, J., Allard-Vannier, E., Herve-Aubert, K., Souce, M., Chourpa, I. Design strategies of hybrid metallic nanoparticles for theragnostic applications. Nanotechnology. 24, 432002 (2013).
- Wei, Q., Wei, A. Optical imaging with dynamic contrast agents. Chemistry. 17, 1080-1091 (2011).
- Aaron, J. S., et al. Increased optical contrast in imaging of epidermal growth factor receptor using magnetically actuated hybrid gold/iron oxide nanoparticles. Optics express. 14, 12930-12943 (2006).
- Song, H. -M., Wei, Q., Ong, Q. K., Wei, A. Plasmon-resonant nanoparticles and nanostars with magnetic cores: synthesis and magnetomotive imaging. ACS nano. 4, 5163-5173 (2010).
- Qu, M., et al.
- Jin, Y., Jia, C., Huang, S. -W., Donnell O&39, M., Gao, X. Multifunctional nanoparticles as coupled contrast agents. Nature communications. 1, 41 (2010).
- Wu, C. -H., et al. Versatile Immunomagnetic Nanocarrier Platform for Capturing Cancer Cells. ACS. 7, 8816-8823 (2013).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature nanotechnology. 4, 855-860 (2009).
- Larson, T. A., Bankson, J., Aaron, J., Sokolov, K. Hybrid plasmonic magnetic nanoparticles as molecular specific agents for MRI/optical imaging and photothermal therapy of cancer cells. Nanotechnology. 18, 325101 (2007).
- Yu, H., et al.
- Wang, L., et al.
- Wang, H., Brandl, D. W., Le, F., Nordlander, P., Halas, N. J. Nanorice: a hybrid plasmonic nanostructure. Nano letters. 6, 827-832 (2006).
- Hu, X., et al. Trapping and Photoacoustic Detection of CTCs at the Single Cell per Milliliter Level with Magneto‐Optical Coupled Nanoparticles. Small. 9, 2046-2052 (2013).
- Truby, R. L., Emelianov, S. Y., Homan, K. A. Ligand-mediated self-assembly of hybrid plasmonic and superparamagnetic nanostructures. Langmuir. 29, 2465-2470 (2013).
- Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).
