Syntese af Immunotargeted Magneto-plasmoniske nanoklynger

Summary

Her beskriver vi en protokol til syntese af magneto-plasmoniske nanopartikler med en stærk magnetisk moment og en stærk nær-infrarødt (NIR) absorbans. Protokollen indeholder også antistofkonjugation for nanopartiklerne gennem Fc-delen til forskellige biomedicinske anvendelser, der kræver molekylær målretning.

Abstract

Magnetiske og plasmoniske egenskaber kombineret i et enkelt nanopartikel giver en synergi, der er fordelagtig i en række biomedicinske applikationer, herunder kontrastforbedring i nye magnetomotoriske afbildningsmodaliteter, samtidig indfangning og påvisning af cirkulerende tumorceller (CTCs) og multimodale molekylær billeddannelse kombineret med fototermisk terapi af kræftceller. Disse applikationer har stimuleret betydelig interesse i udvikling af protokoller til syntese af magneto-plasmoniske nanopartikler med optisk absorbans i det nær-infrarøde (NIR) område og en stærk magnetisk øjeblik. Her præsenterer vi en ny protokol til syntese af sådanne hybride nanopartikler, der er baseret på en olie-i-vand mikroemulsion metoden. Det unikke i protokollen beskrevet heri syntese af magneto-plasmoniske nanopartikler i forskellige størrelser fra primære blokke, som også har magnetisk-plasmoniske egenskaber. Denne fremgangsmåde giver nanopartikler med en høj huleversitet magnetiske og plasmoniske funktionaliteter, som er jævnt fordelt over hele nanopartikel volumen. Den hybride nanopartikler kan let funktionaliseret ved at fastgøre antistoffer via Fc-delen forlader Fab-delen, der er ansvarlig for antigenbinding tilgængelige for målretning.

Introduction

Hybrid nanopartikler bestående af forskellige materialer med forskellige fysisk-kemiske egenskaber kan åbne nye muligheder i biomedicinske anvendelser, herunder multimodal molekylær billeddannelse, levering af terapi og overvågning, ny screening og diagnostiske assays ^1-3. Kombinationen af ​​plasmoniske og magnetiske egenskaber i en enkelt nanopartikel er af særlig interesse, fordi det giver en meget stærk lysspredning og absorption tværsnit forbundet med plasmon resonanser og lydhørhed over for et magnetfelt. For eksempel blev magneto-plasmoniske nanopartikler anvendes til at forøge kontrasten i mørke inden billeddannelse af mærkede celler ved at anvende en tidsmæssig signalmodulationen via en ekstern elektromagnet ^3-5. For nylig blev en lignende princip anvendes i udviklingen af ​​en ny afbildningsmodalitet - Magnetisk-fotoakustisk billeddannelse, hvor magnetisk-plasmoniske nanopartikler muliggøre store forbedringer i kontrast og signal-baggrund rotteIO ^6,7. Det blev også vist, at de hybride nanopartikler kan anvendes til samtidig opsamling og påvisning af cirkulerende tumorceller i fuldblod og in vivo ^8,9. Desuden er magnetisk-plasmoniske nanopartikler lovende theranostic midler, som kan anvendes til molekylær specifik optisk og MR billeddannelse kombineret med fototermisk terapi af cancerceller ^10.

Adskillige fremgangsmåder blev udforsket til syntese af magneto-plasmoniske nanopartikler. For eksempel Yu et al. Udnyttet nedbrydning og oxidation af Fe (CO) ₅ om guld nanopartikler til at danne håndvægt-lignende bifunktionelle Au-Fe ₃ O ₄ nanopartikler ^11. Wang et al. Har syntetiseret guldbelagt jernoxid nanopartikler ved hjælp af termisk nedbrydning metode ^12. Nogle andre tilgange afhængige overtrækspolymer eller aminfunktionelle molekyler på magnetiske kerne nanopartikler efterfulgt af aflejring af aggamle Shell på polymeroverfladen til at skabe den hybride partikler ^7,13. Desuden blev jern-oxid nanopartikler bundet til guld nanorods via elektrostatiske interaktioner eller en kemisk reaktion ^14,15. Selv om disse metoder giver magneto-plasmoniske nanostrukturer de kompromis til dels egenskaber af magneto-plasmoniske kombination såsom optisk absorbans i det nær-infrarøde (NIR) vindue eller en stærk magnetisk moment som begge er meget ønskelige i biomedicinske anvendelser. For eksempel håndvægt Au-Fe ₃ O ₄ nanopartikler har en plasmonresonans top ved 520 nm, hvilket begrænser deres anvendelighed in vivo på grund af høj væv turbiditet i dette spektralområde. Endvidere er de magnetisk-plasmoniske nanopartikler fremstillet ved nuværende protokoller begrænset til kun ét ¹¹ eller få (mindre end 10) ^14,15 superparamagnetiske dele (fx jernoxid nanopartikler), der er betydeligt mindre end hvad der kunne achieved i en tætpakket nanostruktur. For eksempel kan en tætpakket 60 nm diameter sfærisk nanopartikel indeholde på rækkefølgen af ​​et tusind af 6 nm superparamagnetiske nanopartikler. Derfor er der en stor plads til forbedring magnetiske egenskaber af den hybride nanopartikler. Endvidere er nogle af de tidligere beskrevne protokoller er relativt komplekse og kræver omhyggelig optimering for at undgå partikelaggregering under syntesen ^14,15.

Her beskriver vi en protokol til syntese af magneto-plasmoniske nanopartikler med en stærk magnetisk moment og en stærk NIR absorbans, der løser store begrænsninger i den aktuelle kunst. Syntesen har sin oprindelse i olie-i-vand mikroemulsion metode ^16. Den er baseret på samling af nanopartikler af en ønsket størrelse fra en meget mindre primære partikler. Denne fremgangsmåde er med held blevet anvendt til at fremstille nanostrukturer fra et enkelt materiale, såsom guld, jernoxid og halvleder primary partiklerne ^16. Vi har udvidet det til syntese af magneto-plasmoniske nanopartikler ved først at lave 6 nm diameter guld Shell / jernoxidkernen partikler, og derefter samle de primære hybrid partikler i den endelige sfæriske nanostruktur. Montering primære partikler i nanoklynger gør ikke blot forbedrer egenskaberne af konstituerende nanopartikler, såsom at opnå en stærkere magnetisk øjeblik, mens superparamagnetiske egenskaber bevares, men også udnytter samspillet mellem de enkelte nanopartikler og dermed skaber nye egenskaber fraværende fra de konstituerende nanopartikler, såsom stærk optisk absorbans i NIR-vinduet. Denne protokol giver hybrid nanopartikler med en høj tæthed af magnetiske og plasmoniske funktionaliteter. Efter primære partikler syntetiseres vores metode er i det væsentlige en enkel one-pot-reaktion. Den samlede plasmonresonans styrke og magnetisk moment bestemmes ved en række af primære partikler, og therør, kan let optimeres afhængig af en ansøgning. Desuden har vi også udviklet en procedure for antistofkonjugation til de hybride nanopartikler til forskellige biomedicinske anvendelser, der kræver molekylær målretning. Antistoffer bundet via Fc-delen forlader Fab-delen, der er ansvarlig for antigenbinding tilgængelige for målretning.

Protocol

1. Instrumentation og glas Forberedelse

1. Bær passende beskyttelsesudstyr, dvs en laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller.
2. Tilslut en rundbundet kolbe til en kondensator og nedsænkes i en silikone oliebad med en temperaturovervågning af et termometer. Placer en varmekilde (f.eks varmeplade) under oliebad (figur 1). Brug et termometer stand til at måle temperaturen højere end 260 ° C.

2. Syntese af primær Hybrid Magneto-plasmoniske Nanopartikler

1. Making magnetisk kerne Nanopartikler
   1. Tilføj 353,2 mg (1 mmol) jern (III) acetylacetonat, 1 ml (2 mmol) oliesyre, 1 ml (2 mmol) oleylamin, 1.292 g (5 mmol) 1,2-hexadecanediol og 10 ml phenylether til en runde Bunden kolbe.
   2. Blandingen omrøres kraftigt ved hjælp af en magnetisk omrørerstav og opvarmes til 250-260 ° C i 1 time under tilbagesvaling. Derefter vente på opløsningen kølened til stuetemperatur. Kontroller temperaturen er under 260 ° C for at forhindre kogning af phenyletheren og forhindre et burst af reaktionsblandingen fra rundbundet kolbe til kondensatoren.
      ADVARSEL: Reaktionsblandingen er meget varmt og de ​​kemikalier kan forårsage irritation. Skal fungere under en emhætte og bære passende personlige værnemidler. Sørg for tilstrækkelig ventilation til oliebad.
      BEMÆRK: oliebad holdes ved 250-260 ° C temperatur i 1 time under syntesen af ​​de magnetiske nanopartikler. I princippet kan en pyrexglas skål anvendes til dette formål. Men den maksimale kontinuerlige temperatur for pyrexglas er ~ 260 ° C i henhold til leverandøroplysninger. Derfor er en metalbeholder giver en mere sikker løsning for reaktionen, da det kan modstå en højere temperatur og holder længere under flere kørsler.
2. Deposition en guld shell på magnetiske kerne nanopartikler
   1. Tilføj 411,5 mg (1,1 mmol) guld esTate, 0,25 ml (0,75 mmol) oliesyre, 1,5 ml (3,0 mmol) oleylamin, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-hexadecanediol, og 15 ml phenylether til en rundbundet kolbe.
   2. Tilsæt 5 ml suspension af magnetiske nanopartikler fra trin 2.1. Opvarm reaktionsblandingen til 180 ° C og holdes under tilbagesvaling i 1 time. Vent til opløsningen køle ned til stuetemperatur.
   3. 50 ml ethanol til udfældning af hybride primære nanopartikler efterfulgt af centrifugering ved 3.250 x g i 15 min.
   4. Resuspender bundfaldet i 25 ml hexan ved hjælp af en bad-sonikator. Der tilsættes 25 ml ethanol til udfældning af de primære hybrid nanopartikler. Der centrifugeres ved 3.250 x g i 15 minutter og resuspenderes bundfaldet i hexan. Gentag dette trin tre gange.
   5. Tør de udfældede primær hybrid nanopartikler i vakuum O / N. Bekræft, at partiklerne er helt tørre.

3. Hybrid Magneto-plasmoniske nanoklynger Syntese og størrelse Adskillelse

1. Tilsæt opløsningen fra trin 3,1-10 ml vandig opløsning af natriumdodecylsulfat (2,8 mg / ml) i et 20 ml hætteglas med påsatte hætter. Tilføj suspensionen af ​​primær hybrid nanopartikler dråbe for dråbe at undgå at blande de to faser, før det næste skridt.
2. Sonikeres to-fase-opløsning i et bad-sonikator i 2 timer, efterfulgt af opvarmning i et vandbad ved 80 ° C i 10 min. Vent til opløsningen køle ned til stuetemperatur.
   1. Fyld vand på det operationelle niveau linje i ultralydsbad. Centrere hætteglas i ultralydsbad. En emulsion former umiddelbart mellem de to faser. Ryst tofasede opløsning manuelt, efter begyndelsen af ​​lydbehandling; det letter blanding mellem fase indeholdende primære hybrid nanopartikler og bunden vandige fase.
      BEMÆRK: Vær opmærksom that sonikatoren vil varme op efter 2 timer af operationen.
3. Centrifugeres hybrid nanocluster suspensionen ved 100 x g i 30 minutter. Saml både bundfaldet og supernatanten. Resuspender bundfaldet i 0,1 mM natriumcitrat i 10 min sonikering. Den forventede størrelse af nanoklynger er ~ 180 nm i diameter.
4. Overfør supernatanten fra trin 3.3 til en ny konisk rør.
5. Centrifugeres suspensionen fra trin 3.4 ved 400 xg i 30 minutter. Saml både bundfaldet og supernatanten. Resuspender bundfaldet i 0,1 mM natriumcitrat i 10 min sonikering. Den forventede størrelse af nanoklynger er ~ 130 nm i diameter.
6. Overfør supernatanten fra trin 3,5 til en ny konisk rør.
7. Centrifugeres suspensionen fra trin 3,6 ved 1.500 xg i 30 minutter. Bundfaldet og resuspender i 0,1 mM natriumcitrat i 10 min sonikering. Den forventede størrelse af nanoklynger er ~ 90 nm i diameter.
8. Tilsæt 300 _6, l nanocluster suspensionen til en 96-brønds mikropladelæser til måling af en UV-Vis-NIR-spektrum. Drop 10 pi nanocluster suspensionen på carbon-belagt kobber nettet for TEM billeddannelse.

4. Konjugering af monoklonale antistoffer til nanoklynger

1. Forbered 100 pi opløsning af monoklonalt antistof (1 mg / ml) i PBS, pH 7,2, fx anti-epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) antistoffer eller anti-epidermal vækstfaktor receptor 1 (EGFR) antistoffer.
2. Tilsæt antistof opløsningen fra trin 4,1-3,9 ml 4 mM HEPES, pH 7,2. Centrifuger opløsningen gennem en 10 K MWCO centrifugal filter ved 3.250 xg i 20 minutter ved 8 ° C. Resuspender antistoffet i 4 mM HEPES, pH 7,2, til et slutvolumen på 100 ul.
   BEMÆRK: Dette trin udføres for at erstatte det originale medier i antistofopløsningen med HEPES.
3. Tilsæt 10 ul 100 mM NAIO _4-100 ul antistof løsning. Dæk reaktionshætteglasset med en aluminum folie ved stuetemperatur og blandes i 30 minutter under anvendelse af en orbitalryster.
4. Stands reaktionen ved tilsætning af 500 pi 1x PBS.
5. Tilsæt 2 pi 46,5 mM linker opløsning (dithiolaromatic PEG6-CONHNH ₂₎ til antistoffet løsning fra trin 4.4 og rystes i 1 time ved stuetemperatur.
6. Opløsningen filtreres under anvendelse af en 10 k MWCO centrifugefilter ved 3.250 xg i 20 minutter ved 8 ° C. Resuspender antistoffet i 1x PBS til et slutvolumen på 100 ul, hvilket fører til en antistofkoncentration på ~ 1 mg / ml.
7. Bland 100 ul nanocluster suspensionen ved OD ~ 1,0 med 1 pi modificerede antistoffer fra trin 4.6 (1 mg / ml) i 120 minutter ved stuetemperatur.
8. Tilsæt 10 ul 10 ^-3 M 5 kDa thiol- PEG og rystes i 15 minutter ved stuetemperatur.
9. Centrifugeres opløsningen ved 830 x g i 3 minutter. Bortkast supernatanten og resuspender sedimentet i 100 pi 2% w / v 5 kDa PEG i PBS, pH 7,2.
10. Absorbansen spektrum af antistof-konjugeret nanoklynger og sammenlign than absorbansspektret af de nøgne nanoklynger. Forvent et par nanometer rødforskydning efter konjugation.
11. Hvis nanopartiklerne aggregere som vist ved en betydelig ændring med en stigning i OD rød-NIR-området, øge koncentrationen af thiol-PEG til 5 x 10 ^-3 M. Også øge inkubationstiden med thiol PEG til 30 minutter og mindske centrifugalkraften hastighed i trin 200 xg.
12. For kræft cellemærkning test, tilsæt antistof konjugerede nanopartikler fra trin 4,9 til kræft celle suspension i enten medium eller 1x PBS (1 ml ~ 10 ⁶ celler) og bland i 60 min.

Representative Results

En ordning til syntese af immunotargeted magneto-plasmoniske nanoklynger er vist i figur 2. Først magnetiske Fe ₃ O ₄ jernoxid nanopartikler syntetiseret via termisk nedbrydning metode. Derefter er en tynd ca. 1 nm guld shell aflejret på jernoxid kernepartikler via termisk nedbrydning. Den primære ca 6 Nm hybrid nanopartikler tjene som frø til at skabe magneto-plasmoniske nanoklynger ved at bruge en olie-i-vand mikroemulsion tilgang. De nanoklynger funktionaliseres med monoklonale antistoffer til molekylær målretning.

Størrelsen af ​​as-syntetiserede jernoxidkernen nanopartikler er ~ 5 nm i diameter. Efter guld skalafsætningstest på den magnetiske kerne, til ~ 6 nm i diameter størrelsen af ​​primære jernoxidkernen / guld shell nanopartikler stiger. De kolloide farveskift fra brun til jernoxid nanopartikler til rød-lilla efter aflejring af guld skallen og,endelig, til lilla-grå farve efter montering af de primære partikler ind i ~ 180 nm diameter sfæriske nanoklynger (figur 3). UV-Vis-spektre viser, at den primære jernoxidkernen / guld shell nanopartikler har en karakteristisk resonans top ved 530 nm, der ikke er til stede i bare jernoxidpartikler (Figur 4). Ved klyngedannelse, spektret ændres markant, og udviser en stærk bred NIR absorbans (Figur 4).

De nanoklynger konjugeres med monoklonale antistoffer til specifikt at målrette biomolekyler af interesse. Konjugeringen protokollen udnytter en heterofunktionel polyethylenglycol (PEG)-linker, der lægger Fc-regionen af ​​antistoffer til nanocluster overflade. Den ene ende af linkeren har en hydrazid del, som vekselvirker med oxideret glycosyleret antistof del. Den anden ende af linkeren indeholder en di-thiol-gruppe, der har en stærk affinitet til guld overflade nanoklynger. Til demonstrate molekylær målretning har vi valgt en EGFR-positiv hudkræft cellelinie (A-431) og en HER2-positiv brystcancer-cellelinie (SK-BR-3). Nanoclusters blev funktionaliseret med enten anti-EGFR eller anti-HER2-antistoffer efterfulgt af blanding med A-431 eller SK-BR-3 cancerceller hhv. I figur 5 en lys guld-orange farve på A-431 og SK-BR-3-cancerceller viser molekylær specifikke binding af nanoklynger tilsvarende receptorer på kræftceller. I modsætning hertil har målrettede PEGylerede nanoklynger ikke interagerer med kræftceller. Disse resultater viser molekylær specificitet funktionaliserede nanoklynger.

Figur 1. Et forsøgsopstilling til syntese af primære jernoxid kerne / guld shell nanopartikler. En rundbundet kolbe forbundet til en kondensator. Reaktionen udføres i et oliebad under temperaturovervågning af et termometer.

Figur 2. En skematisk illustrerer vigtige skridt i syntese af immunotargeted magneto-plasmoniske nanoklynger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. TEM billeder og farver af kolloide suspensioner af nanopartikler: (venstre) jernoxidkernen nanopartikler; (i midten) guld-belagt jernoxid nanopartikler; (højre) hybrid magneto-plasmoniske nanoklynger. Målestokken for TEM billeder er 50 nm. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. (A) UV-Vis-NIR spektre af jernoxidkernen nanopartikler (blå), guld-coatet jernoxid nanopartikler (grøn) og hybride magnetoresistive plasmoniske nanoklynger (rød). (B) UV-Vis-NIR spektre af hybride magneto-plasmoniske nanoklynger med forskellige størrelser: 90 nm (blå), 130 nm (grøn) og 180 nm (rød). Alle spektre er normaliseret til en ved den maksimale absorbans for at vise forskelle i spektrale profiler. Klik her for at se en større version af dette tal. ANK "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Molekylær specificitet af antistof konjugeret magneto-plasmoniske nanoklynger: (Venstre) EGFR udtrykker et-431 hudkræft celler inkuberet med EGFR-målrettede nanoklynger; (Midt) HER2 udtrykker SK-BR-3 brystkræftceller inkuberet med HER2-rettet nanoklynger; (til højre) A-431 celler inkuberet med målrettede PEGylerede nanoklynger. Den gul-orange farve af celler indikerer vellykket mærkning af de funktionaliserede nanoklynger; grå-blålig farve svarer til en endogen spredning af celler. Billederne er erhvervet ved hjælp af opretstående mikroskop med 20x mørke felt mål, og Xe lampe excitation. Målestokken er 10 um._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1. Denne video sammenligner en reaktion af A-431 cancerceller mærket med enten primære nanopartikler eller nanoklynger til et eksternt magnetfelt. Begge partikeltyper hvor konjugeret med anti-EGFR-antistoffer til specifik målretning af EGFR (+) A431-celler. Først blev et Eppendorf-rør fyldt med en suspension af mærkede celler. Derefter blev en magnet placeres ved siden af røret og bevægelse af celler blev afbildet ved ca. 10 mm væk fra magneten. Filmen til venstre viser celler mærket med primære nanopartikler (6 nm i diameter), og filmen til højre - Celler mærket med magneto-plasmoniske nanoklynger (100 nm i diameter). Filmene er erhvervet ved anvendelse af en omvendt mikroskop i lyse-field mode med en 20X mål. Målestokken er 100 um.

Discussion

Kritiske trin i en vellykket syntese af magneto-plasmoniske nanoklynger omfatter gør meget monodisperse primær guld Shell / jernoxidkernen nanopartikler og lede selvsamling af de primære partikler i nanoklynger. Et molforhold mellem de primære partikler og overfladeaktive midler spiller en vigtig rolle i bestemmelse af størrelsesfordelingen af ​​nanoklynger. Ikke-ensartet størrelse fordeling af primære nanopartikler kan forårsage dannelse af store aggregater under samling af magnetisk-plasmoniske nanoklynger. Desuden mikroemulsionen metode nanocluster dannelse afhængig amfifile overfladeaktive stoffer: hydrofobe halegrupperne holde primære nanopartikler sammen og hydrofile hovedgrupper stabilisere nanoklynger i en vandig opløsning. Koncentration af overfladeaktive bestemmer nanocluster samling: en høj koncentration ville føre til dannelse af mindre nanoklynger eller individuelle primære partikler og en lav koncentration vil resultere i partikelaggregering.

ca 50 nm til cirka 300 nm, der kræver en ekstra adskillelse skridt. Centrifugering med en gradvist stigende hastighed som beskrevet i protokollen ovenfor giver gode resultater med separerede fraktioner har størrelsesfordelinger 90 ± 18 nm, 130 ± 26 nm og 180 ± 39 nm. Finere adskillelse for at producere smallere distributioner bør være muligt ved hjælp af en gelpermeationskromatografi. Det skal også bemærkes, at de nanoklynger har et bredt absorbans i rød-NIR-området, der giver mulighed for at ophidse plasmon resonanser med nogen kilder mellem ca 500 og 900 nm (figur 4). Men denne egenskab begrænser også anvendeligheden af ​​nanoklynger i samtidige billeddannelse af flere mål.

En hydrodynamiske radius af nanoklynger stiger med ~ 10-15 nm efter antistofkonjugation. Denne stigning i diameter korrelerer welll med ca 12 nm størrelsen af et IgG-antistof, der er bundet via Fc-del til overfladen af nanopartikler. Derfor ændringen i den hydrodynamiske diameter er i overensstemmelse med den retningsbestemte konjugationskemi af antistoffer via Fc-delen, der er implementeret i protokollen. Zetapotentialet af nanopartikler skifter fra -47,6 mV før antistofkonjugation til -7,0 mV efter konjugering. Ændringen af ​​overfladen opladning giver yderligere bevis for antistofkonjugation til nanoklynger.

Det unikke i protokollen beskrevet heri syntese af magneto-plasmoniske nanopartikler i forskellige størrelser fra primære blokke, som også har magnetisk-plasmoniske egenskaber. Denne metode giver en enkel måde til samtidig at styre styrken af ​​plasmoniske og magnetiske egenskaber af de resulterende nanostrukturer. I modsætning til tidligere anvendte protokoller en samling af plasmoniske og magnetisk nanomateriales hvor et materiale tjente som en skabelon for aflejring af den anden; i denne fremgangsmåde et materiale optager volumen og den anden overflade af de resulterende nanostrukturer. Magneto-plasmoniske nanopartikler rapporteret i litteraturen har betydeligt lavere tæthed og det samlede beløb af superparamagnetiske partikler i forhold til de nanoklynger foretaget af vores protokol ^14,15. I vores fremgangsmåde magnetiske og plasmone dele er ensartet fordelt i hele mængden af ​​hybrid magneto-plasmoniske nanopartikler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint	Corning	4320A-50	Thermal decomposition reaction
PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints	Corning	2480-300	Thermal decomposition reaction
Silicone oil	Fisher	S159-500	Oil bath
Hot plate stirrer	Corning	PC-351	Heat the reacton with stirring function
Thermometer	ThermoWorks	221-092	Measure temperature
Iron(III) acetylacetonate	Fisher	AC11913-0250	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Oleic acid 99%	Fisher	A195-500	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Gold(III) acetate	Fisher	AA3974206	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Hexane	Fisher	H292-1	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Phenyl ether 99%	Fisher	AC13060-0025	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
1,2-Hexadecanediol 90%	Sigma	213748-50G	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Oleylamine 70%	Sigma	O7805-100G	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Sodium dodecyl sulfate	Fisher	BP166-100	Cluster synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma	W302600	Cluster synthesis
Monoclonal anti-EGF receptor antibody	Sigma	E2156	Cell labeling specificity test
Monoclonal anti-HER2 antibody	Sigma	AMAB90627	Cell labeling specificity test
Sodium periodate	Sigma	311448	Oxidate Fc region of antibodies
Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2	SensoPath Technologies	SPT-0014B	Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters
Methoxy-PEG-thiol, 5 k	Creative PEGworks	PLS-604	Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation
Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane	Millipore	UFC801008	Protein purification
HEPES	Sigma	H3375	Buffer
PBS, 1x solution	Fisher	BP2438-20	Buffer
UV-Vis spectroscopy	BioTek	Synergy HT	Obtain spectrum
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Separation
Transmission Electron Microscope	FEI	TECNAI G2 F20 X-TWIN	Obtain morphology of nanostructures
Upright microscope	Leica	DM6000	Obtain dark-field images
Sonicator	Branson	1510	Sonication
Carbon film 300 mesh grid	EMS	CF300-Cu	TEM imaging
96-well plate	Corning	09-761-145	UV-Vis reading plate