Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic עם מומנט מגנטי חזק וספיג חזק קרוב אינפרא אדום (NIR). הפרוטוקול כולל גם נטיית נוגדן לחלקיקים דרך מחצית Fc עבור יישומים ביו שונים הדורשים מיקוד ספציפי מולקולרי.
Abstract
תכונות מגנטיות וplasmonic המשולבים בחלקיק יחיד לספק סינרגיה שהיא יתרון במספר היישומים ביו כוללים שיפור לעומת בשיטות הדמיה magnetomotive רומן, ללכוד בו זמנית וזיהוי של תאים סרטניים במחזור (CTCs), והדמיה מולקולרית multimodal בשילוב עם טיפול photothermal של תאים סרטניים. יישומים אלה עוררו עניין רב בפיתוח פרוטוקולים לסינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic עם הספיגה אופטית באזור הקרוב אינפרא אדום (NIR) ומומנט מגנטי חזק. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חדש לסינתזה של חלקיקים היברידיים כזה שמבוסס על שיטת microemulsion שמן במים. התכונה הייחודית של הפרוטוקול המתואר במסמך זה סינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic בגדלים שונים מלוקים עיקריים שיש גם מאפיינים מגנטו plasmonic. גישה זו מניבה חלקיקים עם דן גבוהsity של פונקציות מגנטיות וplasmonic אשר מופצות באופן אחיד לאורך כל חלקיק הנפח. חלקיקים היברידיים יכולים להיות פונקציונליות בקלות על ידי הצמדת נוגדנים דרך מחצית Fc עוזב את חלק Fab כי הוא אחראי לאנטיגן מחייב זמין למיקוד.
Introduction
חלקיקים היברידיים המורכב מחומרים שונים בעלי תכונות physicochemical שונות יכולים לפתוח הזדמנויות חדשות ביישומים ביו כולל הדמיה multimodal מולקולרית, משלוח טיפול וניטור, הקרנה חדשה ומבחני אבחון 1-3. השילוב של תכונות plasmonic והמגנטיות בחלקיק בודד הוא עניין מיוחד משום שהוא מספק חתכים חזקים מאוד פיזור אור וקליטה הקשורים לתהודות plasmon והיענות לשדה מגנטי. לדוגמא, חלקיקים מגנטו plasmonic שמשו להגדלת ניגוד בהדמיה כהה תחום התאים שכותרתו על ידי יישום אפנון אות זמני באמצעות אלקטרומגנט חיצוני 3-5. לאחרונה, עיקרון דומה יושם בפיתוח של שיטה חדשה הדמיה - הדמיה מגנטה photoacoustic, שבו חלקיקים מגנטו plasmonic יאפשר שיפורים גדולים בניגוד ועכברוש אות לרקעio 6,7. כמו כן, הראה כי חלקיקים היברידיים יכולים לשמש ללכידה וזיהוי של תאים סרטניים במחזור דם כולו וin vivo 8,9 בו זמנית. יתר על כן, חלקיקים מגנטו plasmonic מבטיחים סוכני theranostic אשר יכול לשמש להדמיה אופטית וMR ספציפי מולקולרית בשילוב עם טיפול photothermal של תאי סרטן 10.
מספר גישות נחקרו לסינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic. לדוגמא, יו et al. פירוק וחמצון של Fe (CO) מנוצל 5 על חלקיקי זהב כדי ליצור Au-Fe 3 O 4 חלקיקי bifunctional כמו משקולת-11. וואנג et al. יש מסונתז חלקיק תחמוצת ברזל מצופה זהב בשיטה פירוק תרמי 12. כמה גישות אחרות מסתמכות על מולקולות תפקודיות פולימר ציפוי או אמין על חלקיקי ליבה מגנטיים ואחריו בתצהיר של agפגז ישן על גבי משטח הפולימר ליצור היברידי חלקיקי 7,13. בנוסף, חלקיקי תחמוצת הברזל הוצמדו לnanorods זהב באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות או תגובה כימית 14,15. למרות שגישות אלו יניבו ננו מגנט plasmonic, הם מתפשרים לכמה מאפיינים במידה של שילוב מגנט plasmonic כגון הספיגה אופטית בחלון קרוב אינפרא אדום (NIR) או מומנט מגנטי חזק אשר שניהם רצויים מאוד ביישומים ביו. לדוגמא, יש לי משקולת Au-Fe 3 O 4 חלקיקים לשיא תהודת plasmon ב520 ננומטר אשר מגביל השירות שלהם in vivo עקב עכירות רקמה גבוהות בטווח הספקטרום הזה. יתר על כן, חלקיקים מגנטו plasmonic מיוצרים על ידי פרוטוקולים הנוכחיים מוגבלים רק אחד 11 או כמה (פחות מ -10) 14,15 moieties פאראמגנטי (למשל, חלקיקי תחמוצת ברזל) שהוא פחות באופן משמעותי מיכול להיות ACHieved בnanostructure צפוף. לדוגמא, חלקיק כדורי 60 קוטר ננומטר צפוף יכול להכיל על סדר אלף של 6 חלקיקי פאראמגנטי ננומטר. לכן, יש חדר גדול לשיפור תכונות מגנטיות של חלקיקים היברידיים. יתר על כן, חלק מהפרוטוקולים שתוארו לעיל הם יחסית מורכב ודורש אופטימיזציה זהירה על מנת להימנע מהצטברות של חלקיקים במהלך הסינתזה 14,15.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic עם מומנט מגנטי חזק וספיגת NIR חזקה המתייחסת מגבלות עיקריות של האמנות העכשווית. יש סינתזת מקורו בשיטת microemulsion נפט במים 16. הוא מבוסס על הרכבה של חלקיקים בגודל רצוי מחלקיקים יסודיים הרבה יותר קטנים. גישה זו שמשה בהצלחה לייצר ננו מחומר אחד, כגון זהב, תחמוצת ברזל, ופרי של מוליכים למחצהmary חלקיקי 16. הרחבנו אותו לסינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic על ידי, ראשון, מה שהופך את חלקיקי ליבת תחמוצת פגז בקוטר זהב 6 ננומטר / ברזל ו, אז, הרכבת החלקיקים היברידיים העיקריים לnanostructure הכדורי הסופי. הרכבת חלקיקים עיקריים לnanoclusters לא רק מאפשר שיפור התכונות של חלקיקים המרכיבים את, כגון השגת מומנט מגנטי חזק יותר תוך שמירה על מאפייני פאראמגנטי, אלא גם מנצל את האינטראקציות בין חלקיקים בודדים ובכך ליצור מאפיינים חדשים נעדרו מהחלקיקים המרכיבים את, כגון חזק הספיגה אופטית בחלון NIR. פרוטוקול זה מניב חלקיקים היברידיים עם צפיפות גבוהה של פונקציות מגנטיות וplasmonic. לאחר חלקיקים ראשוניים synthetized, השיטה שלנו היא למעשה תגובה בסיר אחד פשוט. כוח תהודת plasmon הכולל והמומנט מגנטי נקבעים על ידי מספר החלקיקים יסודיים ו, therefore, יכול להיות מותאם בקלות בהתאם ליישום. יתר על כן, אנחנו גם פיתחנו הליך לנטיית נוגדן לחלקיקים היברידיים עבור יישומים ביו שונים הדורשים מיקוד ספציפי מולקולרי. נוגדנים מחוברים דרך מחצית Fc עוזב את חלק Fab כי הוא אחראי לאנטיגן מחייב זמין למיקוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 כלי מדידה וכלי זכוכית הכנה
- ללבוש ציוד מתאים מגן, כלומר, חלוק מעבדה, כפפות חד פעמיות, והגנה על העין.
- חבר בקבוק מסביב לתחתית למעבה ולטבול אותו באמבט שמן סיליקון עם ניטור טמפרטורה על ידי מדחום. הנח מקור של חום (למשל, צלחת חמה) מתחת לאמבטית השמן (איור 1). השתמש במד חום ליכולת למדוד את הטמפרטורה גבוהה מ260 C °.
חלקיקים .2 סינתזה של Hybrid הראשי מגנטתי plasmonic
- מה שהופך את מגנטי Core חלקיקים
- הוספת 353.2 מ"ג (mmol 1) ברזל acetylacetonate (III), 1 מ"ל (2 mmol) חומצה אולאית, 1 מ"ל oleylamine (2 mmol), 1.292 g (mmol 5) 1,2-hexadecanediol, ו10 מ"ל אתר פניל לסיבוב בקבוק -bottom.
- מערבבים את התערובת במרץ באמצעות מערבבים בר וחום מגנטיים ל250-260 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בריפלוקס. ואז, לחכות לפתרון להתקררעד RT. ודא שהטמפרטורה היא מתחת 260 C ° למנוע רתיחה של אתר פניל ולמנוע התפרצות של תערובת התגובה מהבקבוק מסביב לתחתית למעבה.
זהירות: תערובת התגובה היא חמה מאוד והכימיקלים עלולים לגרום לגירוי. חייב לפעול תחת מנדף ולהשתמש בציוד מיגון אישי מתאים. להבטיח אוורור נאות לאמבטית השמן.
הערה: אמבט השמנים נשמרים ב250-260 טמפרטורת ºC עבור שעה 1 בסינתזה של חלקיקים המגנטיים. באופן עקרוני, צלחת זכוכית פיירקס יכולה לשמש למטרה זו. עם זאת, הטמפרטורה רציפה המקסימלי לזכוכית פיירקס היא ~ 260 ºC על פי מידע ספק. לכן, מיכל מתכת מספק אפשרות בטוחה יותר לתגובה כפי שהוא יכול לעמוד בטמפרטורה גבוהה יותר ויימשך זמן רב יותר במהלך ריצות מרובות.
- בתצהיר פגז זהב על חלקיקי ליבה מגנטיים
- הוספת 411.5 מ"ג אס (1.1 mmol) זהבטייט, 0.25 מ"ל (0.75 mmol) חומצה אולאית, 1.5 מ"ל oleylamine (3.0 מילימול), 775.3 מ"ג (3 mmol) 1,2-hexadecanediol, ו15 אתר מ"ל פניל בבקבוק מסביב לתחתית.
- הוסף 5 מ"ל השעיה של חלקיקים מגנטיים מצעד 2.1. מחממים את תערובת התגובה ל180 ° C ולשמור תחת ריפלוקס עבור שעה 1. חכה לפתרון להתקרר לRT.
- הוסף 50 מ"ל אתנול כדי לזרז את חלקיקים יסודיים ההיברידי אחריו צנטריפוגה ב 3,250 × גרם במשך 15 דקות.
- Resuspend המשקע ב25 מ"ל הקסאן באמצעות sonicator אמבטיה. הוסף 25 מ"ל אתנול כדי לזרז את חלקיקים היברידיים העיקריים. צנטריפוגה ב3,250 XG במשך 15 דקות ו resuspend המשקע בהקסאן. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
- ייבש את חלקיקים היברידיים העיקרי זירז בO ייבוש ואקום / N. ודא שהחלקיקים הם יבשים לחלוטין.
Nanoclusters .3 היברידי מגנט plasmonic סינתזה והפרדת גודל
- מוסיף את הפתרון משלב 3.1 10 מ"ל תמיסה מימית של סולפט dodecyl נתרן (2.8 מ"ג / מ"ל) בבקבוקון זכוכית 20 מ"ל עם כובעים מצורפים. מוסיף את ההשעיה של ירידת חלקיקים היברידיים העיקרית אחר טיפה, כדי למנוע ערבוב של שני השלבים לפני השלב הבא.
- Sonicate פתרון שני שלבים בsonicator אמבטיה לשעה 2, ואחרי חימום באמבט מים על 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חכה לפתרון להתקרר לRT.
- למלא מים עד הקו ברמה התפעולית של האמבטיה sonication. מרכז את בקבוקון הזכוכית באמבטיה sonication. צורות תחליב מייד בין שני השלבים. לנער את פתרון שני שלבים ביד לאחר תחילת sonication; זה מקל על ערבוב בין השלב המכיל חלקיקים היברידיים ראשוניים והשלב מימיים התחתון.
הערה: שים לב that sonicator יהיה לחמם לאחר 2 שעות של פעולה.
- למלא מים עד הקו ברמה התפעולית של האמבטיה sonication. מרכז את בקבוקון הזכוכית באמבטיה sonication. צורות תחליב מייד בין שני השלבים. לנער את פתרון שני שלבים ביד לאחר תחילת sonication; זה מקל על ערבוב בין השלב המכיל חלקיקים היברידיים ראשוניים והשלב מימיים התחתון.
- צנטריפוגה ההשעיה nanocluster ההיברידית ב100 XG למשך 30 דקות. לאסוף שני המשקע וsupernatant. Resuspend המשקע ב0.1 נתרן ציטרט מ"מ מתחת 10 sonication דקות. הגודל הצפוי של nanoclusters הוא ~ 180 ננומטר בקוטר.
- מעבירים את supernatant מצעד 3.3 לצינור חרוטי חדש.
- צנטריפוגה ההשעיה מהצעד 3.4 ב XG 400 ל30 דקות. לאסוף שני המשקע וsupernatant. Resuspend המשקע ב0.1 נתרן ציטרט מ"מ מתחת 10 sonication דקות. הגודל הצפוי של nanoclusters הוא ~ 130 ננומטר בקוטר.
- מעבירים את supernatant מצעד 3.5 לצינור חרוטי חדש.
- צנטריפוגה ההשעיה מהצעד 3.6 ב1,500 XG למשך 30 דקות. לאסוף את המשקע וגלול בציטרט הנתרן 0.1 מ"מ מתחת 10 sonication דקות. הגודל הצפוי של nanoclusters הוא ~ 90 ננומטר בקוטר.
- הוסף 300 _ההשעיה l nanocluster לקורא microplate 96 היטב למדידת ספקטרום ספיגת UV-Vis-NIR; 6. זרוק 10 השעיה nanocluster μl על רשת נחושת מצופה פחמן להדמית TEM.
.4 הצמידה של נוגדנים חד שבטיים לnanoclusters
- הכן 100 μl פתרון נוגדן חד שבטי (1 מ"ג / מ"ל) ב PBS, pH 7.2, למשל, אנטי עוריות Growth Factor Receptor 2 (HER2) נוגדנים או נוגדנים נגד עוריות Growth Factor Receptor 1 (EGFR).
- מוסיף את פתרון הנוגדן מצעד 4.1-3.9 מ"ל 4 HEPES מ"מ, pH 7.2. צנטריפוגה הפתרון דרך מסנן צנטריפוגלי 10 k MWCO ב3,250 XG עבור 20 דקות ב 8 מעלות צלזיוס. Resuspend הנוגדן ב4 HEPES מ"מ, pH 7.2, לנפח סופי של 100 μl.
הערה: שלב זה מתבצע כדי להחליף את המדיה המקורית בפתרון הנוגדן עם HEPES. - הוסף 10 μl של 100 4-100 μl מ"מ NaIO של פתרון נוגדן. כסה את בקבוקון התגובה עם אלרדיד uminum ב RT ולערבב במשך 30 דקות באמצעות ייקר מסלולית.
- להרוות את התגובה על ידי הוספת 500 μl של 1x PBS.
- הוסף 2 μl של 46.5 פתרון מקשר מ"מ (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2) לפתרון הנוגדנים מהצעד 4.4 ולנער במשך השעה 1 בRT.
- סנן את הפתרון באמצעות מסנן צנטריפוגות 10 k MWCO ב3,250 XG עבור 20 דקות ב 8 מעלות צלזיוס. Resuspend הנוגדן ב1x PBS לנפח סופי של μl 100 שמוביל לריכוז נוגדנים של ~ 1 מ"ג / מ"ל.
- מערבבים 100 השעיה nanocluster μl בOD ~ 1.0 עם 1 μl נוגדנים שונה מצעד 4.6 (1 מ"ג / מ"ל) ל120 דקות ב RT.
- הוסף 10 μl של 10 -3 M 5 kDa תיאול PEG ולנער ל15 דקות ב RT.
- צנטריפוגה הפתרון ב830 x גרם במשך 3 דקות. בטל supernatant וresuspend המשקעים ב100 μl 2% w / v 5 kDa PEG ב PBS, pH 7.2.
- למדוד את ספקטרום הספיגה של nanoclusters הנוגדנים מצומדות ולהשוות לtהוא ספיגת ספקטרום של nanoclusters החשוף. מצפה כמה ננומטר משמרת אדומה לאחר הצמידה.
- אם חלקיקים המצרפי כפי שמוצג על ידי שינוי משמעותי עם עלייה בקוטר חיצוני באזור האדום NIR, להגדיל את הריכוז של PEG תיאול ל5 x 10 -3 מ ' כמו כן, להגדיל את זמן דגירה עם PEG תיאול ל30 דקות ולהקטין את המהירות צנטריפוגלי ב200 מרווחי XG.
- לבדיקת תיוג תא סרטן, להוסיף נוגדן חלקיקים מצומדות מצעד 4.9 להשעיה תא סרטן באו בינוני או 1x PBS (1 מ"ל ~ 10 6 תאים) ומערבבים ל60 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תכנית לסינתזה של nanoclusters מגנט plasmonic immunotargeted מוצגת באיור 2. ראשית, Fe 3 O 4 חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטיים synthetized באמצעות שיטת פירוק תרמית. לאחר מכן, פגז זהב דק בערך 1 ננומטר מופקד על חלקיקי ליבת תחמוצת הברזל באמצעות פירוק תרמי. חלקיקים היברידיים בערך 6 ננומטר העיקרי לשמש כזרעים כדי ליצור nanoclusters מגנט plasmonic על ידי ניצול גישת microemulsion שמן במים. Nanoclusters הם פונקציונליות עם נוגדנים חד שבטיים למיקוד ספציפי מולקולרי.
הגודל של חלקיקי ליבת תחמוצת ברזל כ- מסונתזים הוא ~ 5 ננומטר בקוטר. לאחר בתצהיר פגז זהב על הליבה המגנטית, בגודל של ליבת תחמוצת / עליות פגז זהב ברזל עיקרי חלקיקים ל~ 6 ננומטר בקוטר. שינויי colloidal הצבע מחום לחלקיקי תחמוצת ברזל לאדומים סגול אחרי התצהיר של הפגז והזהב,לבסוף, לצבע סגול אפור לאחר ההרכבה של החלקיקים היסודיים ל~ 180 ננומטר nanoclusters הכדורי בקוטר (איור 3). UV-Vis הספקטרום להראות שיש לי ליבת תחמוצת ברזל העיקרית / חלקיקי פגז זהב לשיא תהודה ייחודי ב530 ננומטר שאינו קיימים בחלקיקי תחמוצת ברזל חשופים (איור 4). עם הקמת אשכול, הספקטרום משתנה במידה ניכרת ומציג ספיגה חזק רחב NIR (איור 4).
Nanoclusters הם מצומדת עם נוגדנים חד שבטיים למקד ספציפית מולקולות ביולוגיות של עניין. פרוטוקול נטיה מנצל מקשר פוליאתילן גליקול heterofunctional (PEG) שמתחבר אזור Fc של נוגדנים על פני השטח nanocluster. קצה אחד של מקשר יש מחצית hydrazide שמקיימת אינטראקציה עם מחצית נוגדן מסוכרת חמצון. הקצה השני של מקשר מכיל קבוצת di-תיאול שיש לו זיקה חזקה למשטח הזהב של nanoclusters. לdemonstratמיקוד מולקולרי דואר שבחרנו שורת EGFR חיובית סרטן העור של תאים (-431) ושורת תאי סרטן השד חיובית HER2 (SK-BR-3). Nanoclusters היה פונקציונליות עם נוגדנים-HER2 אנטי או אנטי EGFR או אחרי ערבוב עם-431 תאים סרטניים או SK-BR-3, בהתאמה. באיור 5, צבע זהב כתום בהיר על-431 וSK-BR-3 תאי סרטן מצביע ספציפי מולקולרי המחייב של nanoclusters למתאים קולטנים בתאים סרטניים. בניגוד לכך, nanoclusters PEGylated לא ממוקד לא באינטראקציה עם תאים סרטניים. תוצאות אלו מראות סגוליות מולקולריות של nanoclusters פונקציונליות.
איור 1 התקנה ניסיונית לסינתזה של חלקיקי ליבה / מעטפת זהב תחמוצת הברזל עיקריים. בקבוק מסביב לתחתית מחובר למעבה. התגובה מתבצע באמבט שמנים תחת ניטור טמפרטורה על ידי מדחום.
איור 2 סכמטי המדגים את שלבים עיקריים בסינתזה של nanoclusters מגנט plasmonic immunotargeted. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 תמונות TEM וצבע של השעיות colloidal של חלקיקים: חלקיקי ליבת תחמוצת ברזל (משמאל); (תיכון) חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה זהב; nanoclusters (מימין) מגנט plasmonic ההיברידי. סרגל קנה מידה לתמונות TEM הוא 50 ננומטר. נ.ב.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 UV-Vis-NIR () הספקטרום של חלקיקי ליבת תחמוצת ברזל (כחול), חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה זהב (ירוק), וnanoclusters מגנט plasmonic ההיברידי (אדום). (B) UV-Vis-NIR ספקטרום של nanoclusters מגנט plasmonic ההיברידי עם גדלים שונים: 90 ננומטר (כחול), 130 ננומטר (ירוק), ו180 ננומטר (אדום). כל הספקטרום מנורמל לאחד בספיגה המקסימלי כדי להראות הבדלים בפרופילי רפאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 סגוליות מולקולרי של nanoclusters מגנט plasmonic נוגדן מצומדות: EGFR (מהשמאל) להביע-431 תאי סרטן העור הודגרו עם nanoclusters ממוקד EGFR; (תיכון) HER2 לבטא בתאי סרטן שד SK-BR-3 הודגרו עם nanoclusters ממוקד HER2; (מימין)-431 תאים הודגרו עם nanoclusters PEGylated לא ממוקד. הצבע הצהוב הכתום של תאים מצביע על תיוג מוצלח על ידי nanoclusters פונקציונליות; צבע אפור כחלחל מתאים לפיזור אנדוגני מהתאים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ הזקוף עם מטרת 20X כהה שדה ועירור מנורת Xe. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר._blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. וידאו זה משווה תגובה של תאי סרטן-431 שכותרתו או על ידי חלקיקים או nanoclusters עיקריים לשדה מגנטי חיצוני. שני סוגי החלקיקים שבו מצומדות עם נוגדנים נגד EGFR למיקוד ספציפי של EGFR (+) תאי A431. ראשית, צינור Eppendorf היה מלא בהשעיה של תאים שכותרתו. לאחר מכן, מגנט הוצב בסמוך לצינור והתנועה של תאים היה צילם בקירוב 10 מ"מ מהמגנט. הסרט בצד השמאל ניתן לראות תאים שכותרתו עם חלקיקים יסודיים (6 ננומטר בקוטר) ואת הסרט מימין - תאים שכותרתו עם nanoclusters מגנט plasmonic (בקוטר 100 ננומטר). הסרטים נרכשו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה במצב בהיר שדה עם מטרת 20X. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בסינתזה מוצלחת של nanoclusters מגנט plasmonic כוללים ביצוע חלקיקי זהב העיקרי monodispersed מאוד פגז / ברזל ליבת תחמוצת ובימוי הרכבה עצמית של החלקיקים היסודיים לnanoclusters. יחס טוחנת בין החלקיקים וחומרים פעילי השטח העיקריים לשחק תפקיד חשוב בקביעת התפלגות גודל של nanoclusters. התפלגות גודל לא אחידה של חלקיקים יסודיים עלולה לגרום להיווצרות של אגרגטים גדולים בהרכבה של nanoclusters מגנט plasmonic. בנוסף, שיטת microemulsion של היווצרות nanocluster מסתמכת על חומרים פעילי שטח amphiphilic: קבוצות זנב הידרופובי להחזיק חלקיקים יסודיים ביחד וקבוצות ראש הידרופילי לייצב nanoclusters בתמיסה מימית. ריכוז של חומרים פעילי שטח קובע הרכבה nanocluster: ריכוז גבוה יוביל להיווצרות של nanoclusters הקטן או חלקיקים יסודיים בודדים וריכוז נמוך יביא לצבירה של חלקיקים.
class = "jove_content"> יש לי nanoclusters מסונתז כ- התפלגות גודל רחבה מבקירוב 50 ננומטר לקליפורניה 300 ננומטר שדורש צעד הפרדה נוסף. צנטריפוגה במהירות גוברת בהדרגה כפי שתואר בפרוטוקול לעיל מייצרת תוצאות טובות עם שברים מופרדים שיש הפצות גודל 90 ± 18 ננומטר, 130 ± 26 ננומטר, ו180 ננומטר ± 39. הפרדת פיינר לייצר הפצות צרות צריכה להיות אפשרית באמצעות כרומטוגרפיה בגודל הדרה. זה צריך להיות גם ציין כי יש לי nanoclusters הספיגה רחבה באזור האדום NIR שמספק הזדמנות לרגש תהודות plasmon עם כל מקורות בין בערך 500 ו900 ננומטר (איור 4). עם זאת, נכס זה גם מגביל את תחולתו של nanoclusters בהדמיה בו זמנית של מספר רב של מטרות.
רדיוס הידרודינמית של עליות nanoclusters על ידי ~ 10-15 ננומטר אחרי נטיית נוגדן. עלייה בקוטר זה בקורלציה well עם בערך 12 גודל ננומטר של נוגדן IgG שמצורף דרך מחצית Fc אל פני השטח של חלקיקים. לכן, השינוי בקוטר הידרודינמית עולה בקנה אחד עם הכימיה נטיה כיוונית של נוגדנים דרך חלק Fc שמיושם בפרוטוקול. פוטנציאל זטה של חלקיקים עובר מ-47.6 mV לפני נטיית נוגדן ל-7.0 mV לאחר הצמידה. השינוי של מטען המשטח מספק עדויות נוספות לנטיית נוגדן לnanoclusters.
התכונה הייחודית של הפרוטוקול המתואר במסמך זה סינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic בגדלים שונים מלוקים עיקריים שיש גם מאפיינים מגנטו plasmonic. שיטה זו מספקת דרך פשוטה לשלוט בו זמנית הכוח של מאפייני plasmonic והמגנטיים של ננו וכתוצאה מכך. בניגוד לכך, פרוטוקולים קודמים שימשו הרכבה של nanomaterial plasmonic והמגנטיהמקום שבו חומר אחד שימש כתבנית לתצהירו של האחר אחד; בגישה זו חומר אחד תופס נפח ושטח האחר של ננו וכתוצאה מכך. יש לי חלקיקי המגנט plasmonic שדווחו בספרות צפיפות והסכום הכולל של חלקיקי פאראמגנטי לעומת nanoclusters שנעשה על ידי הפרוטוקול שלנו 14,15 נמוכים באופן משמעותי. בשיטה שלנו moieties המגנטי וplasmonic הם מפוזרים באופן אחיד לאורך כל הנפח של חלקיקי מגנטים plasmonic היברידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH R01 EB008101 וR01 CA103830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint | Corning | 4320A-50 | Thermal decomposition reaction |
| PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints | Corning | 2480-300 | Thermal decomposition reaction |
| Silicone oil | Fisher | S159-500 | Oil bath |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-351 | Heat the reacton with stirring function |
| Thermometer | ThermoWorks | 221-092 | Measure temperature |
| Iron(III) acetylacetonate | Fisher | AC11913-0250 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleic acid 99% | Fisher | A195-500 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Gold(III) acetate | Fisher | AA3974206 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Hexane | Fisher | H292-1 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Phenyl ether 99% | Fisher | AC13060-0025 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| 1,2-Hexadecanediol 90% | Sigma | 213748-50G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleylamine 70% | Sigma | O7805-100G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-100 | Cluster synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | W302600 | Cluster synthesis |
| Monoclonal anti-EGF receptor antibody | Sigma | E2156 | Cell labeling specificity test |
| Monoclonal anti-HER2 antibody | Sigma | AMAB90627 | Cell labeling specificity test |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | Oxidate Fc region of antibodies |
| Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2 | SensoPath Technologies | SPT-0014B | Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters |
| Methoxy-PEG-thiol, 5 k | Creative PEGworks | PLS-604 | Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801008 | Protein purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffer |
| PBS, 1x solution | Fisher | BP2438-20 | Buffer |
| UV-Vis spectroscopy | BioTek | Synergy HT | Obtain spectrum |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Separation |
| Transmission Electron Microscope | FEI | TECNAI G2 F20 X-TWIN | Obtain morphology of nanostructures |
| Upright microscope | Leica | DM6000 | Obtain dark-field images |
| Sonicator | Branson | 1510 | Sonication |
| Carbon film 300 mesh grid | EMS | CF300-Cu | TEM imaging |
| 96-well plate | Corning | 09-761-145 | UV-Vis reading plate |
References
- Bigall, N. C., Parak, W. J., Dorfs, D. Fluorescent, magnetic and plasmonic—Hybrid multifunctional colloidal nano objects. Nano Today. 7, 282-296 (2012).
- Gautier, J., Allard-Vannier, E., Herve-Aubert, K., Souce, M., Chourpa, I. Design strategies of hybrid metallic nanoparticles for theragnostic applications. Nanotechnology. 24, 432002 (2013).
- Wei, Q., Wei, A. Optical imaging with dynamic contrast agents. Chemistry. 17, 1080-1091 (2011).
- Aaron, J. S., et al. Increased optical contrast in imaging of epidermal growth factor receptor using magnetically actuated hybrid gold/iron oxide nanoparticles. Optics express. 14, 12930-12943 (2006).
- Song, H. -M., Wei, Q., Ong, Q. K., Wei, A. Plasmon-resonant nanoparticles and nanostars with magnetic cores: synthesis and magnetomotive imaging. ACS nano. 4, 5163-5173 (2010).
- Qu, M., et al.
- Jin, Y., Jia, C., Huang, S. -W., Donnell O&39, M., Gao, X. Multifunctional nanoparticles as coupled contrast agents. Nature communications. 1, 41 (2010).
- Wu, C. -H., et al. Versatile Immunomagnetic Nanocarrier Platform for Capturing Cancer Cells. ACS. 7, 8816-8823 (2013).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature nanotechnology. 4, 855-860 (2009).
- Larson, T. A., Bankson, J., Aaron, J., Sokolov, K. Hybrid plasmonic magnetic nanoparticles as molecular specific agents for MRI/optical imaging and photothermal therapy of cancer cells. Nanotechnology. 18, 325101 (2007).
- Yu, H., et al.
- Wang, L., et al.
- Wang, H., Brandl, D. W., Le, F., Nordlander, P., Halas, N. J. Nanorice: a hybrid plasmonic nanostructure. Nano letters. 6, 827-832 (2006).
- Hu, X., et al. Trapping and Photoacoustic Detection of CTCs at the Single Cell per Milliliter Level with Magneto‐Optical Coupled Nanoparticles. Small. 9, 2046-2052 (2013).
- Truby, R. L., Emelianov, S. Y., Homan, K. A. Ligand-mediated self-assembly of hybrid plasmonic and superparamagnetic nanostructures. Langmuir. 29, 2465-2470 (2013).
- Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).
