Summary
यहाँ, हम एक मजबूत चुंबकीय क्षण और एक मजबूत लगभग अवरक्त (NIR) absorbance के साथ चुंबक plasmonic नैनोकणों के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रोटोकॉल भी आणविक विशिष्ट लक्षित की आवश्यकता होती है जो विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एफसी आधा भाग के माध्यम से नैनोकणों के लिए एंटीबॉडी विकार शामिल हैं.
Abstract
एक nanoparticle में संयुक्त चुंबकीय और plasmonic गुण विपरीत उपन्यास magnetomotive इमेजिंग तौर तरीकों में वृद्धि, एक साथ कब्जा और (CTCs) ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी का पता लगाने, और photothermal चिकित्सा के साथ संयुक्त बहुविध आणविक इमेजिंग सहित जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक संख्या में लाभदायक है कि एक तालमेल प्रदान कैंसर कोशिकाओं की. इन आवेदनों लगभग अवरक्त (NIR) क्षेत्र में ऑप्टिकल absorbance और एक मजबूत चुंबकीय क्षण के साथ चुंबक plasmonic नैनोकणों के संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल के विकास में महत्वपूर्ण हित प्रेरित है. यहाँ, हम एक तेल में पानी microemulsion पद्धति पर आधारित है कि इस तरह के संकर नैनोकणों के संश्लेषण के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल की अनूठी विशेषता यह भी चुंबक plasmonic विशेषताएं हैं जो प्राथमिक ब्लॉकों से विभिन्न आकारों की चुंबक plasmonic नैनोकणों के संश्लेषण है. यह दृष्टिकोण एक उच्च मांद साथ नैनोकणों पैदावारसमान रूप से nanoparticle मात्रा भर में वितरित कर रहे हैं जो चुंबकीय और plasmonic कार्यक्षमताओं की चर्चाएं. संकर नैनोकणों आसानी से लक्षित करने के लिए उपलब्ध बाध्यकारी प्रतिजन के लिए जिम्मेदार है कि फैब भाग छोड़ने एफसी आधा भाग के माध्यम से एंटीबॉडी संलग्न द्वारा functionalized किया जा सकता है.
Introduction
विशिष्ट भौतिक गुणों के साथ विभिन्न सामग्रियों से मिलकर हाइब्रिड नैनोकणों बहुविध आणविक इमेजिंग, चिकित्सा वितरण और निगरानी, नई स्क्रीनिंग और नैदानिक assays 1-3 सहित जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में नए अवसर खोल सकते हैं. यह एक चुंबकीय क्षेत्र के plasmon अनुनादों और जवाबदेही के साथ जुड़ा हुआ एक बहुत मजबूत प्रकाश बिखरने और अवशोषण पार वर्गों प्रदान करता है क्योंकि एक nanoparticle में plasmonic और चुंबकीय गुण का संयोजन विशेष रुचि का है. उदाहरण के लिए, चुंबक plasmonic नैनोकणों एक बाहरी विद्युत 3-5 के माध्यम से एक अस्थायी संकेत मॉडुलन लगाने से लेबल की कोशिकाओं के अंधेरे क्षेत्र इमेजिंग के विपरीत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया. चुंबक photoacoustic इमेजिंग, चुंबक plasmonic नैनोकणों विपरीत और संकेत करने वाली पृष्ठभूमि चूहे में काफी सुधार सक्षम जहां - अभी हाल ही में एक समान सिद्धांत एक नई इमेजिंग साधन के विकास में लागू किया गया थाकब 6,7. यह भी संकर नैनोकणों एक साथ कब्जा और पूरे रक्त में और vivo 8,9 में ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि दिखाया गया था. इसके अलावा, चुंबक plasmonic नैनोकणों कैंसर की कोशिकाओं को 10 के photothermal चिकित्सा के साथ संयुक्त आणविक विशिष्ट ऑप्टिकल और एमआर इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो theranostic एजेंट वादा कर रहे हैं.
कई दृष्टिकोण चुंबक plasmonic नैनोकणों के संश्लेषण के लिए पता लगाया गया. Dumbbell तरह bifunctional Au-Fe 3 हे 4 नैनोकणों 11 फार्म करने के लिए सोने के नैनोकणों पर उदाहरण, यू एट अल. उपयोग अपघटन और फे (सीओ) के ऑक्सीकरण के लिए 5. वैंग एट अल. थर्मल अपघटन विधि 12 का उपयोग करके सोने में लिपटे लौह ऑक्साइड nanoparticle संश्लेषित है. कुछ अन्य दृष्टिकोण एजी के बयान से पीछा चुंबकीय कोर नैनोकणों पर कोटिंग बहुलक या एमाइन कार्यात्मक अणुओं पर भरोसासंकर बनाने के लिए बहुलक सतह पर पुराने खोल 7,13 कण. इसके अलावा, लौह ऑक्साइड नैनोकणों electrostatic बातचीत या एक रासायनिक प्रतिक्रिया 14,15 के माध्यम से सोने nanorods से जुड़े थे. इन तरीकों चुंबक plasmonic nanostructures उपज हैं, वे इस तरह के जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में अत्यधिक वांछित हैं, जो दोनों के लगभग अवरक्त (NIR) खिड़की में ऑप्टिकल absorbance या एक मजबूत चुंबकीय क्षण के रूप में चुंबक plasmonic संयोजन से कुछ हद गुणों को समझौता. उदाहरण के लिए, dumbbell Au-Fe 3 हे 4 नैनोकणों के कारण इस वर्णक्रमीय रेंज में उच्च ऊतक मैलापन को विवो में उनकी उपयोगिता को सीमित करता है जो 520 एनएम पर एक plasmon अनुनाद चोटी है. इसके अलावा, मौजूदा प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित चुंबक plasmonic नैनोकणों ACH हो सकता है की तुलना में काफी कम है कि सिर्फ एक 11 या कुछ (कम से कम 10) 14,15 superparamagnetic moieties (जैसे, लोहे के आक्साइड नैनोकणों) तक सीमित हैंएक घनी पैक nanostructure में ieved. उदाहरण के लिए, एक घनी पैक 60 एनएम व्यास गोलाकार nanoparticle एक हजार 6 के एनएम superparamagnetic नैनोकणों के आदेश पर हो सकते हैं. इसलिए, संकर नैनोकणों के चुंबकीय गुण में सुधार के लिए एक महान जगह नहीं है. इसके अलावा, पहले वर्णित प्रोटोकॉल के कुछ अपेक्षाकृत जटिल हैं और संश्लेषण 14,15 दौरान कण एकत्रीकरण से बचने के लिए सावधान अनुकूलन की आवश्यकता होती है.
यहाँ, हम एक मजबूत चुंबकीय क्षण और वर्तमान कला की प्रमुख सीमाओं पते एक मजबूत NIR absorbance के साथ चुंबक plasmonic नैनोकणों के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. संश्लेषण तेल में पानी microemulsion विधि 16 में अपने मूल है. यह एक बहुत छोटे प्राथमिक कणों से एक वांछित आकार के नैनोकणों के विधानसभा पर आधारित है. यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक सोना, लौह ऑक्साइड, और अर्धचालक प्राथमिक के रूप में एक ही सामग्री से nanostructures निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैमरियम 16 कण. हम अंतिम गोलाकार nanostructure में प्राथमिक संकर कणों कोडांतरण, फिर, 6 एनएम व्यास सोना खोल / लोहे के आक्साइड कोर कणों बनाने, से, पहले चुंबक plasmonic नैनोकणों के संश्लेषण के लिए इसे बढ़ाया और. Nanoclusters न केवल ऐसे superparamagnetic संपत्तियों के संरक्षण, जबकि एक मजबूत चुंबकीय क्षण को प्राप्त करने के रूप में घटक नैनोकणों के गुणों को बढ़ाने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी इस प्रकार इस तरह के मजबूत के रूप में घटक नैनोकणों से अनुपस्थित नई विशेषताओं, बनाने व्यक्ति नैनोकणों के बीच बातचीत का लाभ लेता है में प्राथमिक कणों कोडांतरण NIR खिड़की में ऑप्टिकल absorbance. इस प्रोटोकॉल चुंबकीय और plasmonic functionalities के एक उच्च घनत्व के साथ संकर नैनोकणों पैदावार. प्राथमिक कणों synthetized करने के बाद, हमारे विधि अनिवार्य रूप से एक सरल एक बर्तन प्रतिक्रिया है. समग्र plasmon अनुनाद ताकत और चुंबकीय क्षण प्राथमिक कणों और, वहाँ की एक संख्या से निर्धारित होते हैंefore, आसानी से एक आवेदन के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, हम भी आणविक विशिष्ट लक्षित की आवश्यकता होती है जो विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए संकर नैनोकणों के लिए एंटीबॉडी विकार के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है. एंटीबॉडी लक्षित करने के लिए उपलब्ध बाध्यकारी प्रतिजन के लिए जिम्मेदार है कि फैब भाग छोड़ने एफसी आधा भाग के माध्यम से जुड़ी हुई हैं.
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Protocol
1 इंस्ट्रुमेन्टेशन्स और कांच के बने पदार्थ तैयारी
- यानी उपयुक्त सुरक्षा उपकरण, एक प्रयोगशाला कोट, डिस्पोजेबल दस्ताने, और नेत्र सुरक्षा पहनें.
- एक कंडेनसर करने के लिए एक दौर नीचे कुप्पी कनेक्ट और एक थर्मामीटर से तापमान एक निगरानी के साथ एक सिलिकॉन तेल स्नान में विसर्जित कर दिया. तेल स्नान (चित्रा 1) के तहत गर्मी का एक स्रोत (जैसे, गर्म थाली) रखें. तापमान अधिक से अधिक 260 डिग्री सेल्सियस को मापने में सक्षम एक थर्मामीटर का उपयोग करें.
प्राथमिक हाइब्रिड के 2 संश्लेषण चुंबक नैनोकणों plasmonic
- चुंबकीय कोर नैनोकणों बनाना
- एक दौर में 353.2 मिलीग्राम (1 mmol) लोहा (तृतीय) acetylacetonate, 1 मिलीलीटर (2 mmol) ओलिक एसिड, 1 मिलीलीटर (2 mmol) oleylamine, 1.292 ग्राम (5 mmol) 1,2-hexadecanediol, और 10 मिलीलीटर फिनाइल ईथर जोड़ें -bottom कुप्पी.
- सख्ती भाटा के तहत 1 घंटे के लिए 250-260 डिग्री सेल्सियस के लिए एक चुंबकीय हलचल बार और गर्मी का उपयोग कर मिश्रण हिलाओ. समाधान शांत करने के लिए फिर, इंतजारआर टी करने के लिए नीचे. तापमान फिनाइल ईथर के उबलते को रोकने और कंडेनसर करने दौर नीचे कुप्पी से प्रतिक्रिया मिश्रण का एक फट रोकने के लिए 260 डिग्री सेल्सियस नीचे है सुनिश्चित करें.
चेतावनी: प्रतिक्रिया मिश्रण बहुत गर्म है और रसायन जलन हो सकती है. एक धूआं हुड के तहत काम करते हैं और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने चाहिए. तेल स्नान के लिए पर्याप्त वेंटिलेशन सुनिश्चित करें.
नोट: तेल स्नान चुंबकीय नैनोकणों के संश्लेषण के दौरान 1 घंटे के लिए 250-260 डिग्री सेल्सियस तापमान पर रखा जाता है. सिद्धांत रूप में, एक Pyrex कांच पकवान इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, Pyrex कांच के लिए अधिकतम निरंतर तापमान विक्रेता जानकारी के अनुसार डिग्री सेल्सियस ~ 260 है. इसलिए, एक धातु कंटेनर यह एक उच्च तापमान को झेलने और कई रन के दौरान लंबे समय तक पिछले कर सकते हैं के रूप में प्रतिक्रिया के लिए एक सुरक्षित विकल्प प्रदान करता है.
- चुंबकीय कोर नैनोकणों पर एक सोने खोल बयान
- 411.5 मिलीग्राम (1.1 mmol) सोने इक्का जोड़ेंटेट, 0.25 मिलीग्राम (0.75 mmol) ओलिक एसिड, 1.5 मिलीग्राम (3.0 mmol) oleylamine, एक दौर नीचे कुप्पी को 775.3 मिलीग्राम (3 mmol) 1,2-hexadecanediol, और 15 मिलीलीटर फिनाइल आकाश.
- कदम 2.1 से चुंबकीय नैनोकणों के 5 मिलीलीटर निलंबन जोड़ें. 180 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण गर्मी और 1 घंटे के लिए भाटा के तहत रहते हैं. आरटी को शांत करने के लिए समाधान के लिए प्रतीक्षा करें.
- 15 मिनट के लिए 3,250 × जी पर centrifugation द्वारा पीछा संकर प्राथमिक नैनोकणों वेग को 50 मिलीलीटर इथेनॉल जोड़ें.
- एक स्नान sonicator का उपयोग करके 25 एमएल हेक्सेन में वेग Resuspend. प्राथमिक संकर नैनोकणों वेग को 25 मिलीलीटर इथेनॉल जोड़ें. 15 मिनट के लिए 3,250 XG पर अपकेंद्रित्र और हेक्सेन में वेग resuspend. इस चरण में तीन बार दोहराएँ.
- एक निर्वात desiccator हे / एन में उपजी प्राथमिक संकर नैनोकणों सूखी. कण पूरी तरह से सूख रहे हैं कि पुष्टि करें.
3 हाइब्रिड चुंबक plasmonic nanoclusters संश्लेषण और आकार पृथक्करण
- संलग्न टोपी के साथ एक 20 मिलीलीटर कांच की शीशी में 3.1-10 मिलीलीटर कदम से सोडियम dodecyl सल्फेट (2.8 मिलीग्राम / एमएल) के जलीय घोल समाधान जोड़ें. अगले कदम से पहले दो चरणों के मिश्रण से बचने के लिए ड्रॉप द्वारा प्राथमिक संकर नैनोकणों बूंद के निलंबन जोड़ें.
- 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक नहाने के पानी में हीटिंग द्वारा पीछा 2 घंटे के लिए एक स्नान sonicator में दो चरण समाधान, Sonicate. आरटी को शांत करने के लिए समाधान के लिए प्रतीक्षा करें.
- Sonication के स्नान का परिचालन स्तर लाइन को पानी भरें. Sonication के स्नान में कांच की शीशी केंद्र. तुरंत दो चरणों के बीच एक पायसन रूपों. Sonication की शुरुआत के बाद हाथ से दो चरण समाधान हिला; इस प्राथमिक संकर नैनोकणों युक्त चरण और नीचे जलीय चरण के बीच मिश्रण की सुविधा.
नोट: Tha जागरूक बनोsonicator टी आपरेशन के 2 घंटे बाद तक गर्मी जाएगा.
- Sonication के स्नान का परिचालन स्तर लाइन को पानी भरें. Sonication के स्नान में कांच की शीशी केंद्र. तुरंत दो चरणों के बीच एक पायसन रूपों. Sonication की शुरुआत के बाद हाथ से दो चरण समाधान हिला; इस प्राथमिक संकर नैनोकणों युक्त चरण और नीचे जलीय चरण के बीच मिश्रण की सुविधा.
- 30 मिनट के लिए 100 XG पर संकर nanocluster निलंबन अपकेंद्रित्र. वेग और सतह पर तैरनेवाला दोनों लीजिए. 10 मिनट sonication के तहत 0.1 मिमी सोडियम साइट्रेट में वेग Resuspend. nanoclusters की उम्मीद आकार व्यास में ~ 180 एनएम है.
- एक नए शंक्वाकार ट्यूब कदम 3.3 से सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
- 30 मिनट के लिए 400 XG पर 3.4 कदम से निलंबन अपकेंद्रित्र. वेग और सतह पर तैरनेवाला दोनों लीजिए. 10 मिनट sonication के तहत 0.1 मिमी सोडियम साइट्रेट में वेग Resuspend. nanoclusters की उम्मीद आकार व्यास में ~ 130 एनएम है.
- एक नए शंक्वाकार ट्यूब को 3.5 कदम से सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
- 30 मिनट के लिए 1500 XG पर कदम 3.6 से निलंबन अपकेंद्रित्र. 10 मिनट sonication के तहत 0.1 मिमी सोडियम साइट्रेट में वेग और resuspend लीजिए. nanoclusters की उम्मीद आकार ~ व्यास में 90 एनएम है.
- 300 जोड़ें _6, एक यूवी विज़-NIR अवशोषण स्पेक्ट्रम को मापने के लिए एक 96 अच्छी तरह से microplate पाठक एल nanocluster निलंबन. मंदिर इमेजिंग के लिए कार्बन लेपित तांबे ग्रिड पर 10 μl nanocluster निलंबन गिरा.
Nanoclusters लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 4 संयुग्मन
- 100 μl मोनोक्लोनल एंटीबॉडी समाधान पीबीएस में (1 मिलीग्राम / एमएल), पीएच 7.2, जैसे, विरोधी epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2) एंटीबॉडी या विरोधी epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 1 (EGFR) एंटीबॉडी तैयार करें.
- 3.9 मिलीलीटर 4 मिमी HEPES, पीएच 7.2 के लिए कदम 4.1 से एंटीबॉडी समाधान जोड़ें. अपकेंद्रित्र 8 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 3,250 XG पर एक 10 कश्मीर MWCO केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से समाधान. 100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए, 4 मिमी HEPES, 7.2 पीएच में एंटीबॉडी Resuspend.
नोट: यह चरण HEPES साथ एंटीबॉडी समाधान में मूल मीडिया को बदलने के लिए किया जाता है. - एंटीबॉडी समाधान के 100 मिमी NaIO 4-100 μl के 10 μl जोड़ें. एक अल साथ प्रतिक्रिया शीशी कवरआरटी पर uminum पन्नी और एक कक्षीय प्रकार के बरतन का उपयोग कर 30 मिनट के लिए मिश्रण.
- 1x पीबीएस के 500 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाने.
- कदम 4.4 से एंटीबॉडी समाधान के लिए 46.5 मिमी linker समाधान के 2 μl (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2) जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए हिला.
- 8 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 3,250 XG पर एक 10 कश्मीर MWCO अपकेंद्रित्र फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर. ~ 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एंटीबॉडी एकाग्रता की ओर जाता है जो 100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए 1x पीबीएस में एंटीबॉडी Resuspend.
- आरटी पर 120 मिनट के लिए कदम 4.6 (1 मिलीग्राम / एमएल) से 1.0 1 μl ~ आयुध डिपो में संशोधित एंटीबॉडी 100 μl nanocluster निलंबन मिलाएं.
- 10 -3 एम 5 केडीए thiol खूंटी के 10 μl जोड़ें और आरटी पर 15 मिनट के लिए हिला.
- 3 मिनट के लिए 830 x जी पर समाधान अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस, पीएच 7.2 में / 5 वी केडीए खूंटी डब्ल्यू 100 μl 2% में तलछट resuspend.
- एंटीबॉडी संयुग्मित nanoclusters के absorbance स्पेक्ट्रम उपाय और टी तुलनावह नंगे nanoclusters के स्पेक्ट्रम absorbance. संयुग्मन के बाद नैनोमीटर लाल पारी के एक जोड़े की अपेक्षा करें.
- नैनोकणों के रूप में लाल NIR क्षेत्र में आयुध डिपो में वृद्धि के साथ एक महत्वपूर्ण बदलाव से दिखाया सकल हैं, 5 एक्स 10 -3 एम को thiol खूंटी की एकाग्रता में वृद्धि इसके अलावा, 30 मिनट के लिए thiol खूंटी साथ ऊष्मायन समय बढ़ाने के लिए और 200 XG वेतन वृद्धि में केन्द्रापसारक गति कम हो.
- कैंसर सेल लेबलिंग परीक्षण के लिए, या तो मध्यम या 1x पीबीएस (1 मिलीलीटर ~ 10 6 कोशिकाओं) में कैंसर सेल निलंबन के लिए कदम 4.9 से एंटीबॉडी संयुग्मित नैनोकणों जोड़ने और 60 मिनट के लिए मिश्रण.
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Representative Results
Immunotargeted चुंबक plasmonic nanoclusters के संश्लेषण के लिए एक योजना चित्रा 2 में दिखाया गया है. पहले, चुंबकीय Fe 3 हे 4 लोहे के आक्साइड नैनोकणों थर्मल अपघटन विधि के माध्यम से synthetized रहे हैं. फिर, एक पतली सीए 1 एनएम सोना खोल थर्मल अपघटन के माध्यम से लोहे के आक्साइड कोर कणों पर जमा किया जाता है. बीज एक तेल में पानी microemulsion दृष्टिकोण का उपयोग करके चुंबक plasmonic nanoclusters बनाने के रूप में प्राथमिक सीए 6 एनएम संकर नैनोकणों सेवा करते हैं. nanoclusters आणविक विशिष्ट लक्षित के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ functionalized रहे हैं.
के रूप में संश्लेषित लोहे के आक्साइड कोर नैनोकणों के आकार व्यास में ~ 5 एनएम है. चुंबकीय कोर पर सोना खोल बयान के बाद, प्राथमिक लौह ऑक्साइड कोर / स्वर्ण खोल नैनोकणों का बढ़ता आकार व्यास में ~ 6 एनएम. सोने खोल और के बयान के बाद लाल बैंगनी के लिए लोहे के आक्साइड नैनोकणों के लिए भूरे रंग से कोलाइडयन रंग बदलता है,अंत में, ~ 180 एनएम व्यास गोलाकार nanoclusters में प्राथमिक कणों की विधानसभा के बाद बैंगनी भूरे रंग के लिए (चित्रा 3). यूवी विज़ स्पेक्ट्रा प्राथमिक लोहे के आक्साइड कोर / स्वर्ण खोल नैनोकणों नंगे लौह ऑक्साइड के कणों में मौजूद नहीं है कि 530 एनएम (चित्रा 4) में एक विशिष्ट गूंज शिखर पता चलता है कि. क्लस्टर गठन पर, स्पेक्ट्रम स्पष्ट रूप से बदलता है और एक मजबूत व्यापक NIR absorbance (चित्रा 4) दर्शाती है.
nanoclusters विशेष रूप से ब्याज की biomolecules लक्षित करने के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित हैं. संयुग्मन प्रोटोकॉल nanocluster सतह के लिए एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र देता है कि एक heterofunctional पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) linker का इस्तेमाल करता. संयोजक के एक छोर ऑक्सीकरण ग्लाइकोसिलेटेड एंटीबॉडी आधा भाग के साथ सूचना का आदान प्रदान, जो एक hydrazide आधा भाग है. linker के दूसरे छोर nanoclusters की सोने की सतह के लिए एक मजबूत संबंध है जो एक डि-thiol समूह में शामिल है. Demonstrat करने के लिएई आणविक लक्ष्यीकरण हम एक EGFR सकारात्मक त्वचा कैंसर कोशिका लाइन (ए 431) और एक HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर कोशिका लाइन (एस-BR-3) को चुना है. Nanoclusters क्रमशः, ए 431 या एसके बी.आर. -3 कैंसर कोशिकाओं के साथ मिश्रण द्वारा पीछा विरोधी EGFR या या तो विरोधी HER2 एंटीबॉडी के साथ क्रियाशील थे. चित्रा 5 में, ए 431 और एस बीआर -3 कैंसर की कोशिकाओं पर एक चमकदार सोने नारंगी रंग कैंसर की कोशिकाओं पर रिसेप्टर्स इसी को nanoclusters के बंधन आणविक विशिष्ट इंगित करता है. इसके विपरीत, अलक्षित PEGylated nanoclusters कैंसर कोशिकाओं के साथ बातचीत नहीं की थी. इन परिणामों functionalized nanoclusters की आणविक विशिष्टता दिखा.
चित्रा 1 प्राथमिक लोहे के आक्साइड कोर / स्वर्ण खोल नैनोकणों के संश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप. एक दौर नीचे कुप्पी एक कंडेनसर से जुड़ा है. प्रतिक्रिया एक थर्मामीटर से तापमान की निगरानी के तहत एक तेल स्नान में किया जाता है.
चित्रा 2 एक योजनाबद्ध immunotargeted चुंबक plasmonic nanoclusters का संश्लेषण में प्रमुख कदम illustrating. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 मंदिर छवियों और नैनोकणों कोलाइडयन निलंबन का रंग: (बाएं) लोहे के आक्साइड कोर नैनोकणों; (मध्य) सोने में लिपटे लोहे के आक्साइड नैनोकणों; (सही) संकर चुंबक plasmonic nanoclusters. मंदिर छवियों के लिए स्केल बार 50 एनएम है. पुनश्च: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4 (ए) यूवी विज़-NIR लोहे के आक्साइड कोर नैनोकणों के स्पेक्ट्रा (नीला), सोने में लिपटे लोहे के आक्साइड नैनोकणों (हरा), और संकर चुंबक plasmonic nanoclusters (लाल). (बी) यूवी विज़-NIR स्पेक्ट्रा विभिन्न आकारों के साथ संकर चुंबक plasmonic nanoclusters की: 90 एनएम (नीला), 130 एनएम (हरा), और 180 एनएम (लाल). सभी स्पेक्ट्रा वर्णक्रमीय प्रोफाइल में मतभेद दिखाने के लिए अधिकतम absorbance में एक को सामान्यीकृत कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. ANK "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5 एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबक plasmonic nanoclusters की आणविक विशिष्टता: (बाएं) EGFR EGFR-लक्षित nanoclusters साथ incubated A-431 त्वचा कैंसर की कोशिकाओं को व्यक्त; (मध्य) HER2 HER2-लक्षित nanoclusters साथ incubated एसके बी.आर. -3 स्तन कैंसर की कोशिकाओं को व्यक्त; अलक्षित PEGylated nanoclusters साथ incubated (सही) ए 431 कोशिकाओं. कोशिकाओं का पीला, नारंगी रंग functionalized nanoclusters से सफल लेबलिंग इंगित करता है; ग्रे नीले रंग की कोशिकाओं से एक अंतर्जात बिखरने से मेल खाती है. छवियों 20X काले क्षेत्र उद्देश्य और Xe दीपक उत्तेजना के साथ ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हासिल किया गया. स्केल बार 10 माइक्रोन है."_blank> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
मूवी 1. यह वीडियो एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र के लिए प्राथमिक नैनोकणों या nanoclusters या तो द्वारा लेबल ए 431 कैंसर कोशिकाओं की एक प्रतिक्रिया तुलना. EGFR (+) A431 कोशिकाओं के विशिष्ट लक्षित के लिए विरोधी EGFR एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित जहां दोनों कण प्रकार. सबसे पहले, एक Eppendorf ट्यूब लेबल की कोशिकाओं के निलंबन से भर गया था. फिर, एक चुंबक ट्यूब और कोशिकाओं की गति के बगल में रखा गया था 10 मिमी दूर चुंबक से सीए में उतारी थी. कोशिकाओं चुंबक plasmonic nanoclusters (व्यास में 100 एनएम) के साथ लेबल - बाईं तरफ फिल्म प्राथमिक नैनोकणों (व्यास में 6 एनएम) और सही पर फिल्म के साथ लेबल की कोशिकाओं से पता चलता है. सिनेमा एक 20x उद्देश्य के साथ उज्ज्वल क्षेत्र मोड में एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हासिल किया गया. स्केल बार 100 मीटर है.
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Discussion
चुंबक plasmonic nanoclusters के सफल संश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम अत्यधिक monodispersed प्राथमिक सोना खोल / लोहे के आक्साइड कोर नैनोकणों बनाने और nanoclusters में प्राथमिक कणों की आत्म विधानसभा निर्देशन में शामिल हैं. प्राथमिक कणों और surfactants के बीच एक दाढ़ अनुपात nanoclusters के आकार के वितरण का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. प्राथमिक नैनोकणों के गैर वर्दी वितरण आकार चुंबक plasmonic nanoclusters की विधानसभा के दौरान बड़ा समुच्चय के गठन के कारण हो सकता है. इसके अलावा, nanocluster गठन की microemulsion विधि amphiphilic surfactants पर निर्भर करता है: हाइड्रोफोबिक पूंछ समूह एक साथ प्राथमिक नैनोकणों पकड़ और हाइड्रोफिलिक सिर समूह एक जलीय घोल में nanoclusters स्थिर. Surfactants की एकाग्रता nanocluster विधानसभा निर्धारित करता है: एक उच्च एकाग्रता छोटे nanoclusters या व्यक्तिगत प्राथमिक कणों और कण एकत्रीकरण में नतीजा होगा एक कम एकाग्रता के गठन के लिए नेतृत्व करेंगे.
एंटीबॉडी संयुग्मन के बाद ~ 10-15 एनएम द्वारा nanoclusters बढ़ जाती है की एक hydrodynamic त्रिज्या. व्यास में यह वृद्धि wel संबद्धनैनोकणों की सतह एफसी आधा भाग के माध्यम से जुड़ा हुआ है कि एक आईजीजी एंटीबॉडी के सीए 12 एनएम के आकार के साथ एल. इसलिए, hydrodynamic व्यास में परिवर्तन प्रोटोकॉल में कार्यान्वित किया जाता है कि एफसी भाग के माध्यम से एंटीबॉडी की दिशात्मक विकार रसायन शास्त्र के अनुरूप है. नैनोकणों जीटा संभावित संयुग्मन के बाद -7.0 एम वी प्रतिरक्षी विकार से पहले -47.6 एम वी से पाली. सतह प्रभारी के परिवर्तन nanoclusters के लिए एंटीबॉडी विकार के अतिरिक्त सबूत उपलब्ध कराता है.
इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल की अनूठी विशेषता यह भी चुंबक plasmonic विशेषताएं हैं जो प्राथमिक ब्लॉकों से विभिन्न आकारों की चुंबक plasmonic नैनोकणों के संश्लेषण है. यह विधि एक साथ जिसके परिणामस्वरूप nanostructures की plasmonic और चुंबकीय विशेषताओं की शक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. इसके विपरीत, पिछले प्रोटोकॉल plasmonic और चुंबकीय nanomaterial की एक विधानसभा इस्तेमाल कियाएक सामग्री एक दूसरे के बयान के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा की है, जहां है; इस दृष्टिकोण में एक सामग्री की मात्रा और जिसके परिणामस्वरूप nanostructures के अन्य सतह पर है. साहित्य में सूचना दी चुंबक plasmonic नैनोकणों काफी कम घनत्व और हमारे प्रोटोकॉल 14,15 द्वारा किए गए nanoclusters की तुलना में superparamagnetic कणों की कुल राशि है. हमारे विधि में चुंबकीय और plasmonic moieties समान रूप से संकर चुंबक plasmonic नैनोकणों की मात्रा भर में वितरित कर रहे हैं.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.
Acknowledgments
यह काम एनआईएच अनुदान R01 EB008101 और R01 CA103830 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint | Corning | 4320A-50 | Thermal decomposition reaction |
| PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints | Corning | 2480-300 | Thermal decomposition reaction |
| Silicone oil | Fisher | S159-500 | Oil bath |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-351 | Heat the reacton with stirring function |
| Thermometer | ThermoWorks | 221-092 | Measure temperature |
| Iron(III) acetylacetonate | Fisher | AC11913-0250 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleic acid 99% | Fisher | A195-500 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Gold(III) acetate | Fisher | AA3974206 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Hexane | Fisher | H292-1 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Phenyl ether 99% | Fisher | AC13060-0025 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| 1,2-Hexadecanediol 90% | Sigma | 213748-50G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleylamine 70% | Sigma | O7805-100G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-100 | Cluster synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | W302600 | Cluster synthesis |
| Monoclonal anti-EGF receptor antibody | Sigma | E2156 | Cell labeling specificity test |
| Monoclonal anti-HER2 antibody | Sigma | AMAB90627 | Cell labeling specificity test |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | Oxidate Fc region of antibodies |
| Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2 | SensoPath Technologies | SPT-0014B | Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters |
| Methoxy-PEG-thiol, 5 k | Creative PEGworks | PLS-604 | Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801008 | Protein purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffer |
| PBS, 1x solution | Fisher | BP2438-20 | Buffer |
| UV-Vis spectroscopy | BioTek | Synergy HT | Obtain spectrum |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Separation |
| Transmission Electron Microscope | FEI | TECNAI G2 F20 X-TWIN | Obtain morphology of nanostructures |
| Upright microscope | Leica | DM6000 | Obtain dark-field images |
| Sonicator | Branson | 1510 | Sonication |
| Carbon film 300 mesh grid | EMS | CF300-Cu | TEM imaging |
| 96-well plate | Corning | 09-761-145 | UV-Vis reading plate |
References
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