ل<em> السابقين فيفو</em> نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري
Summary
لقد قمنا بتطوير رواية فيفو السابقين نموذج لدراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري. لأنه يقوم على المجهرية الأنسجة المعزولة من عينات الأنسجة الثدي الجراحية التي تحافظ العمارة الأنسجة، والتفاعلات بين الخلايا، ونظير الصماوي الإشارات.
Abstract
وقد أعاق دراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري من خلال عدم وجود نظم نموذج كافية. على الثقافة في المختبر، والخلايا الظهارية الثديية الأولية تميل الى فقدان مستقبلات الهرمونات التعبير. على نطاق واسع مستقبلات الهرمونات خطوط خلايا سرطان الثدي إيجابي المستخدمة هي ذات أهمية محدودة إلى الوضع في الجسم الحي. هنا، نحن تصف نموذجا فيفو السابقين لدراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري. وميكانيكيا وإنزيمي هضمها الطازجة عينات أنسجة الثدي الإنسان من المواد تجاهل الجراحية مثل mammoplasties تخفيض أو mammectomies للحصول على شظايا الأنسجة التي تحتوي على قنوات وفصيصات وأنواع الخلايا اللحمية متعددة. هذه المجهرية الأنسجة يوضع في المتوسط القاعدية دون عوامل النمو الحفاظ على اتصالاتهم بين الخلايا، والهندسة المعمارية الأنسجة، وتبقى هرمون استجابة لعدة أيام. يتم معالجتها بسهولة أنها لRNA واستخراج البروتين، والتحليل النسيجي أو تخزينها في تجميد المتوسطة. مضانتنشيط الفرز الخلية (FACS) يمكن استخدامها في تخصيب للسكان خلية معينة. يوفر هذا البروتوكول نهج واضحة، ومعيار للدراسات متعدية مع معقدة للغاية، العينات البشرية المتنوعة.
Introduction
معلومات حول المشهد التحولي في سرطان الثدي يتزايد بوتيرة سريعة. وقد تم إيلاء اهتمام أقل لعوامل النظامية التي تؤثر على تطور سرطان الثدي. التعرض للهرمونات التناسلية له تأثير كبير على تطور المرض 1-3. ومع ذلك، وغير مفهومة الآليات التي الهرمونات الإنجابية تؤثر على الثدي البشري. وقد كشف العمل مع نماذج الماوس المعدلة وراثيا التي تنطوي على الخلية إشارات الجوهرية ونظير الصماوي من خلال العديد من المستجيبات المصب 4.
معرفة محدودة عن عمل الهرمون في الثدي البشري تعزى إلى حد كبير إلى عدم وجود نماذج كافية. وقد تم تنفيذ معظم العمل على آليات مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) ومستقبلات هرمون البروجسترون (PR) إشارات مع خطوط الخلايا مستقبلات هرمون إيجابية سرطان الثدي، مثل MCF-7 و T47D. وقد استمدت هذه من الانصباب الجنبي من المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي المتقدم الذي كان الريدتلقى دى معالجات متعددة 5. أهمية البيولوجية للنتائج في مثل هذه في المختبر نماذج بسيطة من الثدي البشري هي الجينات مشكوك فيها والمستهدفة المحددة في هذه النماذج في المختبر هي تختلف عن الجينات المستهدفة التي يتم تحديدها في النماذج الحيوانية 6. عندما الخلايا الظهارية الأساسي الثدي البشري يتم تربيتها في المختبر أنها تميل الى فقدان التعبير مستقبلات الهرمونات وبالتالي استجابة هرمون 7،8. يمكن circumventd هذه المشكلة عن طريق النهج 3D المتطورة باستخدام matrigel. وبهذه الطريقة، نجح C. كلارك وزملاؤه في إنشاء خلايا الثدي الظهارية التي حافظت مستقبلات الهرمونات التعبير وأظهرت استجابة التكاثري لهرمون البروجسترون التحفيز 9. ومع ذلك، واثنين من المهم في الجسم الحي مستقبلات هرمون البروجسترون الجينات المستهدفة، WNT-4 وRANKL، لم يسببها على التحفيز البروجسترون في هذا النظام 9. وقد اتخذ هذا النهج مؤخرا حول زيادة مع في المختبر </م> وقد تحقق هرمون المعالجة والاستقراء RANKL 10. ويبقى التحذير من أن matrigel له الأنشطة التي تعتمد على دفعة، باهظة الثمن، ويتطلب تصميم التجريبية التي هي عرضة للأرقام زنزانة صغيرة فقط.
وبناء على هذا الاكتشاف أنه في ER الجسم الحي والعلاقات العامة والإشارات بوساطة إلى حد كبير من التفاعلات نظير الصماوي 11، قلنا أن التفاعلات بين الخلايا تحتاج إلى الحفاظ عليها. وفصلها عامل مهم آخر أن تندثر مع أنسجة الخلايا وحيدة للثقافة في المختبر هي تفاعلات الخلايا الظهارية مع المصفوفة خارج الخلية. بعد هذه حاسمة للتمايز الظهارية وتعطيل لها مهم في تكون الأورام 12. مع هذا في الاعتبار، أنشأنا طريقة لعزل المجهرية أنسجة الثدي من المواد الطازجة تجاهل الجراحية 13. لحمة الثدي، ويتألف من ظهارة الطبقات اثنين مع اللمعية الداخلية وmyoepitheli الخارجيخلايا القاعدة ويتم تشريح بعيدا عن الأنسجة الدهنية وتعرض لتفارق الميكانيكية والأنزيمية. بعد غسل والطرد المركزي، ويتم الحصول على أجزاء من قنوات الحليب التي تحتفظ تفاعلات وثيقة مع العديد من الخلايا اللحمية. تبقى هذه المجهرية الأنسجة هرمون استجابة. تم التحقق من صحة النموذج في العينات السريرية 13. على هذا النحو، يمكن أن الإجراء الحالي يساعد على دراسة عمل الهرمونات في الثدي في سياق بيولوجيا وذات الصلة سريريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ثقافة فيفو السابقين الموصوفة هنا يوفر المجهرية أنسجة الثدي تحتوي على قنوات وفصيصات سليمة، جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا الأخرى التي توجد عادة في الإناث الثدي البشري. في تجهيز نسيج الثدي الإنسان عادة ما يتم الحصول عليها من mammoplasties الحد، وإزالة الأنسجة الدهنية، و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر M. فيشه من مستشفى جامعة لوزان لتوفير صورة تصغير او تكبير M. يرث وA. Ayyanan من المعهد السويسري لبحوث السرطان التجريبية، المركز الوطني للبحوث في اختصاص علم الأورام الجزيئية، كلية علوم الحياة، مدرسة الفنون التطبيقية الاتحادية لدي لوزان للحصول على المساعدة الفنية وR. كلارك من جامعة مانشستر للحصول على تعليقات حرجة. تلقت الأبحاث الرائدة لهذه النتائج بدعم من SNF3100A0-112090، Oncosuisse 531817، ومبتكرة الأدوية المبادرة المشتركة تعهد بموجب اتفاقية منحة لا. 115188، موارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7 / 2007-2013) والاتحاد الأوروبي للصناعات الدوائية وجمعيات الشركات في المساهمة العينية. عنوان ويب من مبادرة الأدوية المبتكرة هو http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. ‘Hormonal’ risk factors, ‘breast tissue age’ and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O’Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
