Een<em> Ex vivo</em> Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst
Summary
We hebben een nieuwe ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst bestuderen ontwikkeld. Het is gebaseerd op microstructuren weefsel geïsoleerd uit chirurgische borstweefsel monsters die weefselarchitectuur, intercellulaire interacties en paracrienen behouden.
Abstract
De studie van het hormoon actie in de menselijke borst is belemmerd door een gebrek aan adequate modelsystemen. Bij in vitro cultuur, primaire mamma-epitheliale cellen hebben de neiging om hormoon-receptor expressie te verliezen. Veel gebruikte hormoon-receptor positieve borstkanker cellijnen van beperkte relevantie voor de in vivo situatie. We beschrijven hier een ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst te bestuderen. Verse menselijke specimens borstweefsel van chirurgische discard materiaal zoals vermindering mammoplasties of mammectomies worden mechanisch en enzymatisch verteerd om weefsel fragmenten die leidingen en melkklieren en meerdere stromale celtypen te verkrijgen. Deze weefsel microstructuren in basaal medium bewaard zonder groeifactoren behouden hun intercellulaire contacten, het weefsel architectuur, en blijven hormoon responsieve voor meerdere dagen. Ze worden gemakkelijk verwerkt voor RNA en eiwit-extractie, histologische analyse of opgeslagen in invriesmedium. Fluorescentiegeactiveerde celsortering (FACS) kan worden gebruikt om te verrijken voor specifieke celpopulaties. Dit protocol voorziet in een eenvoudige, standaard aanpak voor translationeel onderzoek met zeer complexe, gevarieerde menselijke specimens.
Introduction
Informatie over de mutatie-landschap bij borstkanker is steeds meer in snel tempo. Minder aandacht is besteed aan systemische factoren die de ontwikkeling van borstkanker beïnvloeden. Blootstelling aan reproductieve hormonen heeft een grote invloed op het ziekteverloop 1-3. Toch zijn de mechanismen die de reproductieve hormonen van invloed zijn op de menselijke borst slecht begrepen. Werken met genetisch gemanipuleerde muis modellen is gebleken dat er sprake is cel intrinsieke en paracrienen via verschillende downstream effectoren 4.
De beperkte kennis hormoonwerking in de menselijke borst is grotendeels toe te schrijven aan een gebrek aan geschikte modellen. De meeste werken op de mechanismen van oestrogeenreceptor (ER) en progesteron receptor (PR) signalering uitgevoerd met hormoonreceptorpositieve borstkanker cellijnen, zoals MCF-7 en T47D. Deze waren afkomstig van pleuravocht van patiënten met gevorderde borstkanker bij wie alrea gehaddy ontving meerdere behandelingen 5. De biologische relevantie van de bevindingen in zulke eenvoudige in vitro modellen van de menselijke borst twijfelachtig en doelgenen die in deze in vitro modellen verschillen van doelgenen die zijn geïdentificeerd in diermodellen 6. Als primaire menselijke borst epitheliale cellen worden gekweekt in vitro ze de neiging om hormoon-receptor expressie en dus hormoon respons 7,8 verliezen. Dit probleem kan worden circumventd door geavanceerde 3D-aanpak met behulp van matrigel. Zo C. Clarke en collega's in geslaagd borst epitheelcellen die hormoonreceptor expressie onderhouden en vertoonden een proliferatieve reactie op progesteron stimulatie 9. Maar twee belangrijke in vivo progesteronreceptor doelwitgenen, Wnt-4 en RANKL, werden niet geïnduceerd na progesteron stimulatie in dit systeem 9. Deze aanpak werd onlangs genomen over verdere met in vitro </em> hormoon voorbehandeling en RANKL inductie werd bereikt 10. Een nadeel blijft dat matrigel heeft activiteiten die batch-afhankelijke, is duur, en eist een experimenteel ontwerp dat geschikt is voor slechts kleine cel aantallen.
Op basis van de bevinding dat in vivo ER en PR signalering worden grotendeels veroorzaakt door paracrine interacties 11, we betoogd dat intercellulaire interacties moeten worden gehandhaafd. Een andere belangrijke factor die verloren weefsels gedissocieerd tot afzonderlijke cellen in vitro cultuur zijn de interacties van de epitheelcellen van de extracellulaire matrix; maar deze zijn van cruciaal belang voor epitheliale differentiatie en hun verstoring is belangrijk bij het ontstaan van tumoren 12. Met dit in het achterhoofd, hebben we een methode om borstweefsel microstructuren te isoleren van verse chirurgische discard materiaal 13. De borst parenchym, bestaande uit twee lagen epitheel met inwendige luminale en uitwendige myoepithelial cellen, wordt verwijderd ontleed uit vetweefsel en onderworpen aan mechanische en enzymatische dissociatie. Na wassen en centrifugeren, worden fragmenten van melkkanalen verkregen die nauwe interactie met vele stromale cellen behouden. Deze weefsel microstructuren blijven hormoon reageren. Het model werd gevalideerd in klinische monsters 13. Als zodanig kan de onderhavige procedure helpen hormoonwerking in de borst bestuderen een biologisch en klinisch relevante context.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ex vivo kweken hier beschreven is borstweefsel microstructuren die intact leidingen en melkklieren, samen met andere celtypen die normaal in het menselijke vrouwelijke borst. Bij de verwerking van de menselijke borst weefsel gewoonlijk verkregen door reductie mammoplasties, verwijdering van vetweefsel, mechanische en enzymatische digestie van de stromale matrix en lysis van rode bloedcellen verrijkt melk duct fragmenten en terminale ductale lobulaire eenheden. Gentle enzymatische digestie op de juiste concen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken M. Fiche van het Universitair Ziekenhuis van Lausanne voor het verstrekken van de mammoplasty foto, M. Wirth en A. Ayyanan van Zwitserse Instituut voor Experimenteel Kankeronderzoek, National Center of Competence in Research Moleculaire Oncologie, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne voor technische bijstand en R. Clarke van de Universiteit van Manchester voor kritische opmerkingen. Het onderzoek leidde tot deze resultaten heeft de steun van SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, en het Innovative Medicines Initiative gemeenschappelijke onderneming onder subsidieovereenkomst kreeg geen. 115.188, middelen van die zijn samengesteld uit financiële bijdrage van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (FP7 / 2007-2013) en de European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations bedrijven 'in natura bijdrage. Het webadres van Innovative Medicines Initiative is http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. ‘Hormonal’ risk factors, ‘breast tissue age’ and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O’Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
