アン<em>エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために>モデル
Summary
私たちは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するための新規のex vivoモデルを開発した。これは、組織構造、細胞間相互作用、およびパラクリンシグナル伝達を維持する外科乳房組織標本から単離された組織の微細構造に基づいている。
Abstract
ヒト乳癌におけるホルモン作用の研究は、適切なモデル系の欠如によって妨げられてきた。 インビトロ培養の際に、一次乳房上皮細胞は、ホルモン受容体の発現を失う傾向がある。広く使用され、ホルモン受容体陽性乳癌細胞株は、in vivoの状況に限定関連のものである。ここでは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するためのex vivoモデルを記述。このような還元mammoplastiesまたはmammectomiesなどの外科廃棄材料からの新鮮なヒト乳房組織標本は、機械的および酵素的に管と小葉及び複数間質細胞タイプを含む組織断片を得るために消化される。これらの組織の微細構造は、それらの間の接触を維持する成長因子を含まない基礎培地中で組織構造を保持し、数日間のホルモン応答性のままである。それらは容易にRNAおよびタンパク質抽出、組織学的分析のために処理または凍結培地中に保存されている。蛍光活性化セルソーティング（FACS）は、特定の細胞集団を濃縮するために使用することができる。このプロトコルは、非常に複雑、多様なヒト検体との翻訳研究のための簡単な、標準的なアプローチを提供します。
Introduction
乳癌における突然変異景観に関する情報は、急速に増加している。以下の注意は、乳癌の発達に影響を与える全身性因子が注目されている。生殖ホルモンへの曝露は、疾患の進行1-3に大きな影響を与えます。しかし、生殖ホルモンはヒト乳房に衝突するメカニズムはよく理解されていない。遺伝子操作したマウスモデルとの仕事は、彼らがいくつかの下流エフェクター4を介して細胞内因性および傍分泌に関与することを明らかにした。
ヒト乳癌におけるホルモン作用についての限られた知識は、適切なモデルの欠如に主に起因している。エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）のシグナル伝達のメカニズムのほとんどの作業は、MCF-7およびT47Dなどのホルモン受容体陽性乳癌細胞株を用いて行われた。これらはalreaいた進行乳癌患者からの胸膜滲出液由来したDYは、複数の治療法5を受け取った。ヒト乳房のような単純なin vitroモデルにおける知見の生物学的関連性は、これらのin vitroモデルで識別さ疑わしいとターゲット遺伝子である動物モデル6で識別された標的遺伝子とは異なります。初代ヒト乳房上皮細胞は、インビトロで培養される場合、それらは、ホルモン受容体の発現、したがって、ホルモン応答7,8を失う傾向がある。この問題は、マトリゲルを使用して洗練された3Dアプローチによってcircumventdすることができます。このように、C·クラークらは、ホルモン受容体の発現を維持し、プロゲステロン刺激9に対する増殖応答を示した乳房上皮細胞を樹立することに成功した。しかし、 生体内プロゲステロン受容体標的遺伝子において重要な二つのWnt-4、RANKL、このシステム9プロゲステロン刺激により誘導されなかった。このアプローチは、最近、 インビトロでさらに上に撮影された</em>のホルモン治療前とRANKL誘導は10を達成した。注意点は、マトリゲルはバッチに依存している活動があることに変わりは高価であり、わずかな細胞数のためになりやすい実験計画を要求する。
インビボでの ERおよびPRシグナル伝達に主としてパラクリン相互作用11によって媒介されるという知見に基づいて、我々は、細胞間相互作用が維持される必要があると主張した。組織は、インビトロ培養のために単一細胞に解離されると失われたもう一つの重要な要因は、細胞外マトリックスと上皮細胞との相互作用である。まだこれらは、上皮分化のために重要であり、その破壊は、腫瘍形成において重要である12。これを念頭において、私たちは新鮮な外科廃棄材13から乳房組織の微細構造を分離する方法を確立した。インナー腔側と外側myoepitheliで二層上皮からなる乳房実質、らの細胞は、脂肪組織から離れて切開し、機械的および酵素的解離に供される。洗浄および遠心分離後、乳管の断片は、多くの間質細胞との密接な相互作用を維持することが求められる。これらの組織の微細構造は、ホルモン応答残る。モデルは、臨床検体13に検証されました。このように、本手順では、生物学的および臨床的に関連する文脈において乳癌におけるホルモン作用を研究するために助けることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するのex vivo培養は、通常、ヒト女性の胸肉で見つかった他の細胞型と一緒に、完全な管および小葉を含む乳房 組織の微細構造を提供しています。ヒト乳房組織の処理では、通常の還元mammoplasties、脂肪組織の除去、間質マトリックスの機械的および酵素的消化から得られ、そして赤血球の溶解は、乳管フラグメントおよび端子乳管小葉単位富化。右の存続期間のための?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、乳房形成の写真を提供するためのローザンヌ大学病院のM.マイクロフィッシュ、M.ワース·実験癌研究のためのスイスの研究所のA. Ayyanan、研究分子腫瘍、生命科学の学校、エコール連邦工科·デ·コンピテンスのナショナルセンターに感謝批判的なコメントのためにマンチェスター大学の技術支援のためのローザンヌとR·クラーク。これらの結果につながる研究なしグラント契約の下でSNF3100A0-112090、Oncosuisse 531817、および革新的な医薬品イニシアティブ共同事業の支援を受けている。 115188、現物出資における製薬産業と協会の企業の欧州連合の第7次フレームワークプログラム（FP7 / 2007年から2013年）と欧州連合からの財政貢献」で構成されているの資源。革新的な医薬品イニシアティブのWebアドレスですhttp://www.imi.europa.eu/ 。</ pの>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
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